今年九月，柴進教授在EMBO Molecular Medicine (IF: 12.137)期刊上在線發(fā)表了題為“A homozygous R148W mutation in Semaphorin 7A causes progressive familial intrahepatic cholestasis”的文章（應用了Absin六色多重熒光免疫組化染色試劑盒——abs50030），提出了SEMA7A（信號素7A）中的一個純合子R148W突變會導致進行性家族性肝內膽汁淤積癥(PFIC)，并對其機制進行了闡述。
進行性家族性肝內膽汁淤積癥（PFIC）是一種常染色體隱性遺傳性肝細胞性膽汁淤積癥，是由于基因突變所致膽汁分泌或排泄障礙形成的綜合征，以嚴重的皮膚瘙癢為特征。本病好發(fā)于兒童，一般在新生兒期就存在肝細胞性原發(fā)性膽汁淤積，在成年前因肝衰竭而死亡。
本次重大發(fā)現(xiàn)就是起因于一個患了PFIC的女嬰，在出生后的前2周表現(xiàn)出長時間的黃疸和腸胃脹氣，接受治療后康復，并沒有什么后遺癥，然而在隨后的檢查中，她的肝功能檢查顯示血清ALT、AST和TBA水平異常高，進一步醫(yī)學檢查排除了各種已知的肝病，于是研究人員就想到了PFIC——一種跟基因有關的肝內膽汁淤積癥，排查了已知的PFIC相關基因在這個孩子體內的突變以后，一個純合子（S267F）突變在該患者的鈉/牛磺膽酸鹽共轉運多肽（NTCP/SLC10A1）中被發(fā)現(xiàn)。雖然NTPC和SLC10A1功能的改變都可能導致類似該患者的癥狀，但是前者不會帶來肝損傷，后者在小鼠模型中也沒有表現(xiàn)出血清ALT、AST和TBA水平的升高，至此，這個病因也被排除。
那么究竟是哪里出了問題？研究團隊繼續(xù)從基因入手，使用各種遺傳模型對WGS數(shù)據進行篩選，最后鎖定了SEME7A基因可能的錯義變異（p.R148W），并且進一步基因檢測結果也證實了患者的SEMA7A的基因組組織以及DNA和蛋白發(fā)生了變異（圖1）。研究團隊隨后建立了Sema7aR145W純合子突變小鼠模型，與野生小鼠和雜合子小鼠比較，該純合子小鼠4周和8周齡血清中ALT、AST和TBA水平升高，并出現(xiàn)肝損傷，這一表現(xiàn)與Sema7aR148W純合子突變的患者十分類似。
PFIC是一種肝內膽汁淤積癥，研究團隊對小鼠模型的肝臟提取物進行LC-MS/MS分析，最后結果顯示了Sema7aR145W純合子突變小鼠模型的肝臟中指示BA肝排泄受損的標志物水平明顯升高，再進一步對小管膜膽汁酸轉運體、基底外側膜膽汁酸轉運體、膽汁酸合成酶的mRNA轉錄產物進行檢測，并對各蛋白進行Western blot檢測，其中最引人注意的是Bsep和Mrp2，這兩個蛋白在純合子小鼠組的表達量明顯低于野生小鼠和雜合子組，但他們mRNA轉錄產物的量并沒有下調（圖2）。
針對兩個特殊的蛋白，研究團隊運用了多重熒光免疫組化技術進行染色，無論是對小鼠肝臟進行檢測還是夾層膠原“三明治”法短期體外培養(yǎng)的原代肝細胞，熒光結果都顯示了Sema7aR145W純合子突變小鼠比野生小鼠組織細胞中的Bsep和Mrp2含量低（圖3）。
對膠原夾心培養(yǎng)中小鼠原代干細胞進行轉染，分別轉染SEMA7A_WT或SEMA7A_R148W結構物，并設置了不同的轉染劑量，進行多染，結果顯示Sema7aR145W突變可降低肝臟Bsep和Mrp2蛋白的表達，并且轉染劑量越高，表達越低，呈劑量依賴性，兩種關鍵蛋白表達的降低最終也導致了肝內膽汁淤積。
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