人外周血淋巴細胞分離液說明書

【包裝規(guī)格】

200ml/瓶

【貨號】

LTS1077

【實驗前準(zhǔn)備】

A． 適用儀器

B． zui大離心力可達 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機

B． 耗材

【檢驗方法】

全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。

首先根據(jù)樣本量大小，分以下幾種情況：

一、 使用 15ml 離心管時：

情況 A：血液樣本量小于 3ml 時，實驗方法如下：

1，取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液。

2，用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到*分離效果）。

3，離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

4，用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。

5，250g，離心 10min。

6，棄上清。

7，用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

8，250g，離心 10min。

9，重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。

情況 B：血液樣本量為 3-6ml 時，實驗方法如下：

1，取一支 15ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。

2，用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，450-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。

3，離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

4，用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。

5，250g，離心 10min。

6，棄上清。

7，用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

8，250g，離心 10min。

9，重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。

二、 使用 50ml 離心管時：

情況 A：血液樣本量為 6-10ml 時，實驗方法如下：

1，取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。

2，用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-950g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。

3，離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

4，用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。

5，250g，離心 10min。

6，棄上清。

7，用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

8，250g，離心 10min。

9，重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。

情況 B：血液樣本量為 10-20ml 時，實驗方法如下：

1，取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。

2，用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-1100g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。

3，離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。

4，用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。

5，250g，離心 10min。

6，棄上清。

7，用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

8，250g，離心 10min。

9，重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。

【注意事項】

全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得*的實驗結(jié)果，在取血 2h 內(nèi)進行實驗，血液存放時間越長，細胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。

本實驗不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導(dǎo)致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細胞分離效果。

吸取過多的淋巴細胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數(shù)量增加。

吸取過多的淋巴細胞層上層溶液會導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

當(dāng)血液樣本粘度過高需稀釋時，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號：2010C1119）1:1 稀釋混勻備用。注：不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞档图毎寐始盎钚浴Ｈ缪簶?/span>

本經(jīng)過稀釋則分離過程中需適當(dāng)降低離心力和離心時間。

【儲存條件及有效期】

18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟

封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

【參考值（參考范圍）】

本實驗淋巴細胞提取率及純度均大于 80%。

下表為成年人外周血中各種細胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進行參考。

【相關(guān)實驗技術(shù)方案】

所獲得淋巴細胞的培養(yǎng)技術(shù)。

所獲得淋巴細胞的核酸提取技術(shù)。

所獲得淋巴細胞的鑒定方法A.流式細胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)

C.原位雜交技術(shù)

【可能存在的問題及解決方法】

1.  由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進行調(diào)整時，恒定離心時間，對離心轉(zhuǎn)速進行調(diào)整。

本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級原料，性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

注：在對離心條件進行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達到*分離效果，離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準(zhǔn)。