一、背景

雞敗血支原體PCR試劑盒是一種用于檢測(cè)雞敗血支原體的PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))試劑盒。雞敗血支原體是一種常見(jiàn)的細(xì)菌病原體，可引起雞的呼吸道、腸道和生殖系統(tǒng)感染，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

該試劑盒通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)雞敗血支原體的DNA，具有高靈敏度和特異性。使用時(shí)，首先需要提取雞樣本中的DNA，然后將提取的DNA加入到PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。如果樣本中存在雞敗血支原體的DNA，則會(huì)顯示出陽(yáng)性結(jié)果。

雞敗血支原體PCR試劑盒廣泛應(yīng)用于家禽養(yǎng)殖業(yè)中，可以幫助養(yǎng)殖戶及時(shí)發(fā)現(xiàn)和控制雞敗血支原體感染，減少疾病的傳播和損失。同時(shí)，該試劑盒也可以用于科學(xué)研究中，幫助研究人員深入了解雞敗血支原體的生物學(xué)特性和致病機(jī)制。

二、雞敗血支原體PCR試劑盒是一種用于檢測(cè)雞敗血支原體的實(shí)驗(yàn)工具。試劑盒具有以下特點(diǎn)：

即開(kāi)即用，用戶只需要提供DNA模板。

引物經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化，專一性強(qiáng)，只擴(kuò)增雞敗血支原體，與其他病原沒(méi)有交叉反應(yīng)。

提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

PCR mix中含上樣染料，PCR后可以直接上樣電泳。

三、雞敗血支原體PCR試劑盒的操作步驟如下：

1、樣本采集：從患者體內(nèi)采集血液、糞便、組織等樣本，并將其保存在無(wú)菌容器中。

2、DNA提?。簩⒉杉降臉颖具M(jìn)行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取試劑盒。提取后的DNA應(yīng)保存在-20°C或更低的溫度下。

3、PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備：根據(jù)試劑盒說(shuō)明書的要求，配制PCR反應(yīng)體系，包括引物、熒光探針、dNTPs、DNA聚合酶等。

4、PCR反應(yīng)：將提取的DNA加入到PCR反應(yīng)體系中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件和時(shí)間根據(jù)試劑盒說(shuō)明書的要求進(jìn)行設(shè)置。

5、結(jié)果分析：將PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)，根據(jù)熒光信號(hào)的出現(xiàn)情況判斷是否存在雞敗血支原體的感染。

四、應(yīng)用

雞敗血支原體PCR試劑盒可以用于雞敗血支原體黏附素GapA的表達(dá)及基因靶向載體的構(gòu)建：

雞敗血支原體(Mycoplasma gallisepticum,MG)能引起雞及其它禽類的慢性呼吸道疾病(Chronic respiratory disease,CRD)和火雞傳染性竇炎(Infectious sinusitis),該病廣泛分布于世界上所有養(yǎng)禽的國(guó)家,且常繼發(fā)或并發(fā)新城疫、傳染性支氣管炎等其他呼吸道傳染病,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。MG感染和寄生最重要的步驟是牢固地黏附在呼吸道黏膜固有層。因此,為了深入研究MG致病機(jī)制,本研究對(duì)MG主要黏附素GapA的相關(guān)免疫特性進(jìn)行探索,并成功構(gòu)建MG通用型轉(zhuǎn)座載體和oriC可復(fù)制型載體用于MG基因靶向缺失研究。

1、雞敗血支原體強(qiáng)弱毒株gapA基因的克隆及序列測(cè)定本研究通過(guò)雞敗血支原體PCR試劑盒RT-PCR和PCR擴(kuò)增MG不同毒力毒株的gapA基因N端序列,測(cè)定各基因片段序列,并比較其在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和序列之間的差異性。

結(jié)果表明：gapA基因存在于一個(gè)大型的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中,與licA、mgc2、crmA三個(gè)基因同在一個(gè)基因簇中;不同毒株之間,gapA基因N端存在明顯的差異,GapA的90～290aa之間即為GapA的高變區(qū)。而對(duì)于Rhigh,常出現(xiàn)在多個(gè)位置插入有單一“A”的現(xiàn)象,如:第105位、385位和910位,導(dǎo)致隨后的基因序列移碼成TAA終止子,致使翻譯提前終止;而對(duì)于ts-11株,gapA N端的第142nt處由“C”突變?yōu)椤癆”,形成TAA密碼子,致使翻譯提前終止。而強(qiáng)毒株Rlow、S6、DC9604和弱毒株F、6/85均能編碼gapA基因全長(zhǎng),編碼大約110～120kD左右的蛋白。這幾個(gè)毒株之間的區(qū)別在于:GapA的N端100300aa之間存在高變區(qū)。這為GapA的表達(dá)和抗體制備奠定了基礎(chǔ)。

2、雞敗血支原體Rlow株GapA氨基端(GapAN)的高效表達(dá)本研究通過(guò)雞敗血支原體PCR試劑盒PCR擴(kuò)增GapA蛋白N端多肽(98322aa)(GapAN)和C端(882aa-1115aa),分別連入pGEX-6P-1載體,轉(zhuǎn)化BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo),結(jié)果發(fā)現(xiàn)GapAN獲得高效表達(dá);而GapA C端未能成功表達(dá)。將GapAN亞克隆入pFAST-Bac1載體中,轉(zhuǎn)座DH10Bac細(xì)菌,通過(guò)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,獲得GapAN的重組桿狀病毒?？笹apAN的多抗利用IFA檢測(cè),結(jié)果顯示:GapAN成功地在桿狀病毒中高效表達(dá)。

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