材料與方法

1.1 材料：

• LNPs的制備：采用微流控混合技術(shù)，將含有CL4F6、磷脂、膽固醇和PEG-DMG的乙醇溶液與含有mRNA的醋酸鹽緩沖液混合，制備LNPs。通過透析和超濾步驟純化LNPs。
• LNPs的表征：使用動態(tài)光散射（DLS）測量LNPs的粒徑、多分散指數(shù)（PDI）和ζ電位。通過核磁共振磷譜（31P NMR）和小角X射線散射（SAXS）分析脂質(zhì)相行為。
• 體內(nèi)實驗：采用BALB/c小鼠模型，通過尾靜脈注射LNPs，評估m(xù)RNA在肝臟中的表達(dá)水平。使用生物發(fā)光成像系統(tǒng)（IVIS）監(jiān)測LNPs在體內(nèi)的分布。

結(jié)果與討論

• DSPC與DOPE對照組：與含有DSPC的LNPs相比，含有DOPE的LNPs并未顯著提高mRNA的表達(dá)水平，這表明單純替換DSPC為DOPE并不能有效改善mRNA的遞送效率。
• DOPE-Cx變體：引人注目的是，含有DOPE-Cx變體（特別是DOPE-C6、C8和C10）的LNPs顯著提高了mRNA在肝臟中的表達(dá)水平。其中，DOPE-C8表現(xiàn)出最高的mRNA表達(dá)水平，相較于DSPC對照組，其Fluc活性提高了數(shù)倍。
• 鏈長依賴性：進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，DOPE-Cx磷脂的疏水鏈長度對mRNA表達(dá)水平有顯著影響。較短的疏水鏈（如C4和C6）和較長的疏水鏈（如C12和C18:1）均未能達(dá)到與DOPE-C8相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)水平，表明存在一個最佳的疏水鏈長度范圍。

31P NMR分析：為了深入理解DOPE-Cx磷脂如何影響LNPs的脂質(zhì)相行為，我們采用了31P核磁共振（NMR）技術(shù)。將DOPE-Cx磷脂與磷脂酰膽堿（POPC）以不同摩爾比混合，并制備成脂質(zhì)懸浮液進(jìn)行NMR分析。

• 層狀相與非層狀相：純DOPE在與POPC混合時，迅速從六方相（H相）轉(zhuǎn)變?yōu)閷訝钕啵↙相）。然而，DOPE-Cx磷脂在與POPC混合時，能夠誘導(dǎo)形成非層狀立方相（Q相），這在NMR譜圖中表現(xiàn)為在0 ppm處出現(xiàn)尖銳的峰。

• 鏈長與相行為：進(jìn)一步的分析表明，DOPE-Cx磷脂的疏水鏈長度對其誘導(dǎo)立方相的能力有顯著影響。較短的疏水鏈（如C4至C8）更有利于立方相的形成，而較長的疏水鏈則傾向于形成六方相。

SAXS與Cryo-TEM驗證：為了進(jìn)一步驗證DOPE-Cx磷脂誘導(dǎo)立方相的形成，我們采用了小角X射線散射（SAXS）和冷凍透射電子顯微鏡（Cryo-TEM）技術(shù)。

• SAXS分析：SAXS譜圖顯示，含有DOPE-C8和POPC的脂質(zhì)懸浮液在低角度區(qū)域出現(xiàn)了特征性的立方相散射峰，進(jìn)一步證實了立方相的存在。

• Cryo-TEM觀察：Cryo-TEM圖像清晰地展示了含有DOPE-C8和POPC的脂質(zhì)納米顆粒內(nèi)部存在有序的立方相結(jié)構(gòu)，這與NMR和SAXS的分析結(jié)果一致。

結(jié)論

參考文獻(xiàn)：Iwakawa, Kazuki, et al. "Cubic Phase‐Inducible Zwitterionic Phospholipids Improve the Functional Delivery of mRNA." Advanced Science (2025): 2413016.