在細(xì)胞生物學(xué)研究中，對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行熒光標(biāo)記和示蹤是觀察細(xì)胞行為、分析細(xì)胞相互作用以及研究細(xì)胞遷移和分布的重要手段。DiR (DiIC18(7))作為一種近紅外熒光的親脂性染料，憑借其染色機(jī)制和優(yōu)異的性能，成為細(xì)胞膜標(biāo)記領(lǐng)域的理想選擇。

一、DiR 的染色機(jī)制與特性

DiR 是一種親脂性、近紅外熒光花青染料，其兩個(gè) 18-碳鏈能夠深入插入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層中。這種特性使得 DiR 能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜的特定且穩(wěn)定的染色。當(dāng) DiR 與細(xì)胞膜結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，同時(shí)光穩(wěn)定性也得到顯著提升。這種熒光增強(qiáng)效應(yīng)歸因于 DiR 分子與細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的緊密相互作用。

DiR 的熒光信號(hào)穩(wěn)定，不易受到光漂白的影響，這使得它在長時(shí)間的觀察和檢測中表現(xiàn)出色。此外，DiR 對(duì)細(xì)胞的毒性極低，通常不會(huì)影響細(xì)胞的正常生理功能和生存力，適用于活細(xì)胞的長期示蹤和觀察。DiR 發(fā)出的近紅外熒光具有較高的組織穿透能力，這使得它在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中能夠更深入地觀察細(xì)胞的分布和遷移情況。

二、DiR 的應(yīng)用領(lǐng)域

細(xì)胞膜標(biāo)記

DiR 最常見的應(yīng)用是對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行標(biāo)記，以觀察細(xì)胞的形態(tài)和行為。在細(xì)胞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞與 DiR 染色液混合孵育，DiR 分子會(huì)迅速插入到細(xì)胞膜中并發(fā)出熒光。通過熒光顯微鏡可以清晰地觀察到細(xì)胞膜的輪廓和形態(tài)變化。

DiR 標(biāo)記的細(xì)胞膜熒光信號(hào)均勻且穩(wěn)定，能夠長時(shí)間保持熒光強(qiáng)度，適用于多種細(xì)胞類型，包括貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。標(biāo)記后的細(xì)胞可以用于后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞相互作用研究等。

細(xì)胞示蹤

DiR 被廣泛用于細(xì)胞示蹤實(shí)驗(yàn)，特別是在深部組織的成像研究中。由于其近紅外熒光特性，DiR 標(biāo)記的細(xì)胞在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中能夠更深入地被觀察，揭示細(xì)胞在生物體內(nèi)的分布、遷移和存活情況。在腫瘤研究中，DiR 標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞被用于觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移路徑和侵襲行為，為腫瘤治療策略的開發(fā)提供了重要數(shù)據(jù)支持。

此外，DiR 還可以用于標(biāo)記和追蹤其他類型的細(xì)胞，如免疫細(xì)胞、干細(xì)胞等。在干細(xì)胞研究中，DiR 標(biāo)記的干細(xì)胞被移植到宿主體內(nèi)后，可以通過熒光成像技術(shù)實(shí)時(shí)觀察干細(xì)胞的歸巢、分化和再生能力，為干細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

三、DiR 的操作使用方法

染色前準(zhǔn)備

在進(jìn)行 DiR 染色之前，需要準(zhǔn)備好細(xì)胞樣本。對(duì)于貼壁細(xì)胞，可以使用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，然后用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌細(xì)胞，去除殘留的培養(yǎng)基成分。對(duì)于懸浮細(xì)胞，直接收集細(xì)胞并進(jìn)行洗滌。將細(xì)胞調(diào)整到合適的濃度，一般為 1×10^5 - 1×10^6 cells/mL，以便于后續(xù)的染色和檢測。

染色過程

將準(zhǔn)備好的細(xì)胞與 DiR 染色液混合，DiR 的常用工作濃度為 1 - 10 μM。將混合后的細(xì)胞懸液置于 37℃、5% CO? 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 10 - 20 分鐘。在孵育過程中，DiR 分子會(huì)插入到細(xì)胞膜中，產(chǎn)生近紅外熒光。孵育時(shí)間可根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的染色效果。

染色后處理

孵育完成后，用 PBS 輕輕洗滌細(xì)胞兩次，去除未結(jié)合的染料。對(duì)于需要進(jìn)行細(xì)胞膜標(biāo)記觀察的樣本，將標(biāo)記后的細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，加入適量的培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于需要進(jìn)行細(xì)胞示蹤實(shí)驗(yàn)的樣本，將標(biāo)記后的細(xì)胞用于后續(xù)的體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn)。使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察時(shí)，設(shè)置 780 nm 的激發(fā)波長和 810 nm 左右的發(fā)射波長檢測通道，收集近紅外熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜的標(biāo)記和示蹤。

四、DiR 的優(yōu)勢與注意事項(xiàng)

優(yōu)勢

• 低細(xì)胞毒性：DiR 對(duì)細(xì)胞的毒性極低，不會(huì)顯著影響細(xì)胞的正常生理功能，適用于長期的細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)觀察。

• 良好的細(xì)胞膜通透性：DiR 能夠快速穿透細(xì)胞膜并插入到脂質(zhì)雙層中，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜的標(biāo)記。

• 穩(wěn)定的熒光信號(hào)：DiR 嵌入細(xì)胞膜后，熒光信號(hào)穩(wěn)定，不易受到光漂白的影響，適合長時(shí)間的熒光觀察和檢測。

• 近紅外熒光：DiR 發(fā)出的近紅外熒光具有較高的組織穿透能力，適用于體內(nèi)深部組織的成像研究。

• 多色熒光標(biāo)記：DiR 可與其他發(fā)出不同顏色熒光的染料（如 DiO、DiI）聯(lián)合使用，實(shí)現(xiàn)多色熒光標(biāo)記，為復(fù)雜生物過程的研究提供了更全面的視角。

注意事項(xiàng)

• 染色濃度優(yōu)化：使用 DiR 時(shí)，需根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需求優(yōu)化染色濃度。濃度過高可能導(dǎo)致細(xì)胞膜過度染色或細(xì)胞毒性增加，而濃度過低則可能使熒光信號(hào)不足。

• 避光操作：DiR 染料對(duì)光敏感，操作過程中應(yīng)盡量減少樣本的光照時(shí)間，以防止熒光淬滅。

• 背景熒光控制：在染色過程中，需確保染色步驟的規(guī)范性，以減少背景熒光。例如，孵育后應(yīng)充分洗滌細(xì)胞，去除未結(jié)合的染料。

• 保存條件：DiR 染料應(yīng)密封保存于干燥、避光的環(huán)境中，避免接觸強(qiáng)光和高溫，以保持其活性和穩(wěn)定性。