材料

方法

1. LNP制備：通過微流控混合法，將脂質(zhì)（ESM、膽固醇、可電離脂質(zhì)、PEG-DMG）與mRNA在乙醇和緩沖液中混合，形成LNP。調(diào)控ESM/膽固醇與可電離脂質(zhì)的摩爾比（RB/I）從9至0.43。

2. 表征：使用冷凍電鏡（cryo-TEM）解析LNP的納米結(jié)構(gòu)，動態(tài)光散射（DLS）測定粒徑，BCA法測定蛋白吸附量，質(zhì)譜分析蛋白冠組成。

3. 體外轉(zhuǎn)染實驗：在Huh7細胞中評估不同RB/I的LNP轉(zhuǎn)染效率。

4. 體內(nèi)實驗：通過尾靜脈注射LNP至CD-1小鼠，使用SPECT/CT成像追蹤體內(nèi)分布，評估脾臟、淋巴結(jié)等組織的轉(zhuǎn)染效率。

實驗結(jié)果

3.1 LNP的形態(tài)與結(jié)構(gòu)：

通過冷凍電鏡（cryo-TEM）對不同RB/I（雙層脂質(zhì)ESM/膽固醇與可電離脂質(zhì)的摩爾比）的LNP進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

RB/I=4：在此比例下，約84%的LNP呈現(xiàn)出典型的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，其核心為電子致密的固態(tài)結(jié)構(gòu)，懸浮于水性腔室中，并被完整的脂質(zhì)雙層包裹。固態(tài)核心占據(jù)LNP內(nèi)部空間的約30%，這一結(jié)構(gòu)特征與預(yù)期相符，表明高比例的雙層脂質(zhì)有助于形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體形態(tài)。

RB/I降低：隨著RB/I值的降低，LNP的形態(tài)逐漸發(fā)生變化。當RB/I降至2.3及以下時，LNP開始呈現(xiàn)出部分脂質(zhì)雙層包裹固態(tài)核心的結(jié)構(gòu)，固態(tài)核心與脂質(zhì)雙層之間的界面變得模糊，部分區(qū)域可見固態(tài)核心直接暴露于水性環(huán)境中。這一現(xiàn)象表明，雙層脂質(zhì)的比例對LNP的形態(tài)具有決定性影響。

Fig. 1 | Morphological and in vitro transfection properties of LNP mRNA systems formulated using various bilayer lipid to ionizable lipid molar ratios (RB/I).

3.2 體外轉(zhuǎn)染效率：

在Huh7細胞中評估不同RB/I的LNP轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示：

高效轉(zhuǎn)染：RB/I=4-0.67的LNP在Huh7細胞中表現(xiàn)出高效的轉(zhuǎn)染能力，其轉(zhuǎn)染效率顯著高于Onpattro樣配方（RB/I≈1）。特別是在RB/I=4時，轉(zhuǎn)染效率達到最高，這一結(jié)果驗證了脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)對提升轉(zhuǎn)染效率的積極作用。

轉(zhuǎn)染效率與形態(tài)的關(guān)系：轉(zhuǎn)染效率與LNP的形態(tài)密切相關(guān)。具有完整脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的LNP（RB/I=4）展現(xiàn)出最高的轉(zhuǎn)染效率，而隨著脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的破壞（RB/I降低），轉(zhuǎn)染效率也隨之下降。這一發(fā)現(xiàn)進一步強調(diào)了脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)在mRNA遞送中的重要性。

3.3 體內(nèi)分布與轉(zhuǎn)染效率：

通過尾靜脈注射LNP至CD-1小鼠，并使用SPECT/CT成像追蹤體內(nèi)分布，結(jié)果顯示：

長循環(huán)特性：與Onpattro樣配方相比，RB/I=4的脂質(zhì)體LNP在血液循環(huán)中的半衰期顯著延長（約15倍）。這一長循環(huán)特性歸因于脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)降低了血漿蛋白的吸附，從而減少了單核-巨噬細胞系統(tǒng)（MPS）的清除。

肝外組織轉(zhuǎn)染：脂質(zhì)體LNP在脾臟和腹股溝淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)染效率分別提高了50倍和150倍。此外，在心臟、乳腺、胰腺等組織中也觀察到了顯著的mRNA表達。這一結(jié)果表明，脂質(zhì)體LNP具有廣泛的組織分布能力，為實現(xiàn)肝外組織的mRNA遞送提供了可能。

3.4 蛋白冠分析：

通過質(zhì)譜分析比較脂質(zhì)體LNP與Onpattro樣LNP的蛋白冠組成，結(jié)果顯示：

蛋白總量減少：脂質(zhì)體LNP的蛋白冠總量比Onpattro樣LNP減少了約2倍。這一減少主要歸因于脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)降低了血漿蛋白的吸附。

特定蛋白吸附降低：在脂質(zhì)體LNP的蛋白冠中，免疫球蛋白Ighv10-1和纖維蛋白原Fgb的吸附顯著降低。這些蛋白的減少有助于降低MPS的識別和清除，從而延長LNP在血液循環(huán)中的時間。

蛋白組成變化：脂質(zhì)體LNP的蛋白冠中，免疫蛋白比例減少了4.4%，而載脂蛋白比例增加了3.6%。這種組成變化可能有助于LNP在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性和靶向性。

3.5 包封和轉(zhuǎn)染過程及相關(guān)機制：

討論

本研究通過調(diào)控雙層脂質(zhì)與可電離脂質(zhì)的摩爾比，成功開發(fā)了一種具有脂質(zhì)體形態(tài)的長循環(huán)LNP-mRNA遞送系統(tǒng)。該系統(tǒng)不僅顯著降低了血漿蛋白吸附，延長了血液循環(huán)半衰期，還在脾臟和淋巴結(jié)等肝外組織中實現(xiàn)了高效的轉(zhuǎn)染。這一突破為mRNA療法在肝外疾病治療中的應(yīng)用提供了新的可能性。

未來的研究將進一步探索該系統(tǒng)在其他肝外組織中的轉(zhuǎn)染效率，并優(yōu)化LNP的配方和制備工藝，以提高其穩(wěn)定性和安全性。

參考文獻：Cheng, Miffy Hok Yan, et al. "Liposomal lipid nanoparticles for extrahepatic delivery of mRNA." Nature Communications 16.1 (2025): 4135.