高效qinliugan病毒小鼠感染模型的構(gòu)建流程

（一）背景

近日，全球病毒網(wǎng)絡(luò) (GVN) 是一個由linxian的人類和動物病毒學(xué)家組成的國際聯(lián)盟，其遍布 40 多個國家的 80 多個zhuoyue中心和附屬機(jī)構(gòu)已在《柳葉刀區(qū)域衛(wèi)生 - 美洲》上發(fā)表了關(guān)于北美正在發(fā)生的 H5N1 qinliugan疫情的詳細(xì)分析和緊急行動呼吁。頂尖科學(xué)家發(fā)表了一項行動呼吁，敦促全球各國政府應(yīng)對北美日益嚴(yán)重的 H5N1 qinliugan疫情，該疫情已感染動物和人類，并造成了重大農(nóng)業(yè)損失。

（二）qinliugan病毒（H5N1/H7N9）小鼠感染模型構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)操作流程

主要儀器設(shè)備：北京元森凱德生物公司研制生產(chǎn)的動物全身/口鼻動態(tài)氣溶膠暴露系統(tǒng)） + YSKD動物氣管肺遞送定向暴露模塊  

生物安全等級：BSL實驗室（符合WHO《實驗室生物安全手冊》第四版） 

一、實驗前準(zhǔn)備

1. 動物選擇與預(yù)處理

6-8周齡SPF級BALB/c或C57BL/6小鼠（優(yōu)先選擇IFNAR1敲除品系以增強(qiáng)病毒易感性），獨(dú)立通風(fēng)籠具（IVC）中預(yù)適應(yīng)7天，溫度22±1℃，濕度50-60%，12小時光照循環(huán)，通過實驗動物福利倫理委員會審批（參考AAALAC國際認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)） 

2. 病毒株與攻毒液配制

病毒株H5N1或H7N9，TCID??測定為1×10?~1×10?/mL，病毒原液以PBS（含0.3% BSA、100 U/mL青霉素/鏈霉素）稀釋至目標(biāo)濃度，分裝后-80℃保存，使用前經(jīng)三次凍融循環(huán)確保病毒顆粒分散 

二、 病毒接種及感染模型構(gòu)建步驟

2.1病毒稀釋：將H5N1qinliugan病毒株用病毒培養(yǎng)基稀釋成不同濃度，低劑量感染組為1×10^4 PFU/mL，高劑量感染組為1×10^6 PFU/mL。

2.2 動物全身動態(tài)吸入/口鼻暴露染毒(北京元森凱德生物技術(shù)公司研制生產(chǎn))

粒徑控制：1-3 μm（模擬呼吸道飛沫核心粒徑） 

暴露時間：全身暴露模式：30分鐘（總病毒載量1×10?~1×10? PFU/只），口鼻暴露模式：15分鐘（靶向劑量1×103~1×10? PFU/只）

2.3動物氣管肺遞送精準(zhǔn)定向暴露

小鼠麻醉：將小鼠放入麻醉誘導(dǎo)箱，使用3%異氟醚誘導(dǎo)麻醉，待小鼠倒立無掙扎后，轉(zhuǎn)入維持濃度為1.5% - 2%的麻醉狀態(tài)。

氣管內(nèi)定量霧化接種：

將麻醉后的小鼠固定在BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD生物安全型小動物固定操作臺上，頭部向上，頸部稍后仰。使用北京元森凱德生物技術(shù)有限公司研制生產(chǎn)的微量氣管內(nèi)液體霧化器【可精準(zhǔn)定量】吸取適量的病毒稀釋液（低劑量組50μL/只，高劑量組100μL/只），經(jīng)BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD小動物可視化插管喉鏡（內(nèi)置微型CMOS攝像頭，支持實時圖像傳輸至外接顯示屏），緩慢插入到小鼠的氣管處，使病毒液霧化噴霧流入氣管。對照組滴加等體積的病毒培養(yǎng)基。

2.4 感染后處理

小鼠轉(zhuǎn)移至生物安全隔離籠具，恢復(fù)自主呼吸，實時監(jiān)測生命體征（呼吸頻率、活動度），記錄感染后0小時基線數(shù)據(jù)。 

三、感染進(jìn)程監(jiān)測

3.1. 臨床觀察與樣本采集

感染后第1、3、5、7天，監(jiān)測指標(biāo)/臨床癥狀：體重下降率（>20%為人道終點(diǎn)）、豎毛、呼吸困難評分（0-4級） 

樣本采集： 

    - 鼻咽拭子（病毒脫落量檢測） 

    - 肺泡灌洗液（BALF，qRT-PCR檢測病毒載量） 

    - 肺組織病理切片（HE染色評估間質(zhì)性肺炎程度） 

3.2. 病毒動力學(xué)分析

qRT-PCR引物設(shè)計：靶向HA基因保守區(qū)（如H5N1 HA-F:5'-CAGCAATGCAGRACAGAT-3'），病毒滴度測定：MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法（TCID??/mL） 

3.3. 免疫應(yīng)答檢測

血清抗體：感染后第14天采集血清，ELISA檢測H5N1特異性IgG（OD450≥0.5為陽性），細(xì)胞免疫：流式細(xì)胞術(shù)分析肺組織CD8? T細(xì)胞比例（CD44?CD62L?效應(yīng)表型） 

四、模型驗證標(biāo)準(zhǔn)

4.1 感染成功率：感染后72小時肺組織病毒載量≥1×10? TCID??/g 

4.2 病理特征：典型肺泡上皮細(xì)胞壞死+淋巴細(xì)胞浸潤（病理評分≥3分） 

4.3一致性驗證：同一批次實驗組內(nèi)個體差異≤15%（CV值） 

五．注意事項

5.1. 實驗人員需全程佩戴正壓防護(hù)服（PAPR）及雙重手套 

5.2. 病毒滅活：所有接觸材料需經(jīng)121℃高壓滅菌30分鐘 

5.3. 動物倫理：體重下降超過25%或出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸困難時立即實施安樂處死(北京元森凱德（YSKD）提供自動型實驗動物安樂窒息系統(tǒng)) 

本方案結(jié)合北京元森凱德生物技術(shù)有限公司,簡稱元森凱德（YSKD）研制生產(chǎn)的高精度氣溶膠全身/口鼻動態(tài)氣溶膠暴露系統(tǒng)） +動物氣管肺遞送定向暴露模塊與閉環(huán)生物安全設(shè)計，確保實驗可重復(fù)性。可滿足qinliugan病毒跨宿主傳播機(jī)制研究、疫苗效力評價等前沿科研需求。

附：北京元森凱德生物技術(shù)有限公司研制生產(chǎn)的動物霧化吸入給藥儀器，主要包括大/小動物肺部氣管直接遞送裝置（動物氣道霧化針）、動物口鼻吸入、僅鼻腔給藥、全身式暴露染毒、動物煙氣/PM2.5染毒系統(tǒng)、粉塵氣溶膠發(fā)生器、臭氧動物暴露裝置、動物高低壓氧艙，此外給客戶多樣化提供自動型實驗動物anlesi系統(tǒng)（窒息系統(tǒng)、二氧化碳安樂處死箱），實驗動物除臭暫存系統(tǒng)，巴馬香豬皮，NGI Gentle Rocker智能洗盤裝置，NGI新一代撞擊器和ACI安德森撞擊器的校驗與檢測。

附：北京元森凱德生物技術(shù)有限公司（BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD），簡稱元森凱德（YSKD），2013年成立于北京中關(guān)村科技園，是一家專業(yè)從事生命科學(xué)類實驗儀器研制、生產(chǎn)與銷售的科技創(chuàng)新型企業(yè)。服務(wù)毒理學(xué)、藥理學(xué)、免疫學(xué)、生物安全、大氣污染物、化學(xué)物質(zhì)毒性鑒定、臨床前藥物開發(fā)與安全性評價、呼吸系統(tǒng)、環(huán)境與健康等領(lǐng)域。

部分用戶案例：哈佛大學(xué)，麻省理工學(xué)院，新加坡國立大學(xué)，瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院，中國科學(xué)院上海藥物研究所，中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，康龍化成（寧波）生物醫(yī)藥有限公司，中日醫(yī)院呼吸病學(xué)研究中心/中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京中醫(yī)藥大學(xué)，中國藥科大學(xué)，沈陽藥科大學(xué)，復(fù)旦大學(xué)，浙江大學(xué)，四川大學(xué)，中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院等