背景介紹：Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus（SFTSV）發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒，屬于布尼亞病毒科（Bunyavirales） 的白蛉病毒屬（Bandavirus），是一種單股負(fù)鏈RNA病毒。主要通過(guò)蜱蟲(chóng)叮咬（如長(zhǎng)角血蜱 Haemaphysalis longicornis） 傳播，也可能通過(guò)接觸患者血液/分泌物發(fā)生人際傳播。由于缺乏特殊的抗SFTSV藥物，存在全球性致死率高的風(fēng)險(xiǎn)。

布帕伐醌（Buparvaquone， BPQ）是第二代羥基萘醌類藥物，作為一種用于治療牛腸桿菌病的抗原蟲(chóng)藥物上市。它代謝緩慢，半衰期長(zhǎng)，毒性低，刺激性小，殘留少，是一種安全的商業(yè)藥物，用于獸醫(yī)治療。大量研究證明，BPQ對(duì)許多原生動(dòng)物，如巴西芽孢桿菌、巴西孢子菌和貝斯諾提菌都有較強(qiáng)的抑制活性，也能抑制猴痘病毒等幾種病毒的感染。但是對(duì)于BPQ的作用機(jī)制尚未wán quán闡明。

上海hǎi jūn第十四軍醫(yī)大學(xué)hǎi jūn醫(yī)學(xué)院戚中田教授團(tuán)隊(duì)從FDA批準(zhǔn)的1400個(gè)小分子中篩選出并確定BPQ是一種有效的SFTSV感染抑制劑；進(jìn)一步的研究揭示了BPQ與病毒包膜糖蛋白Gc在病毒-宿主膜融合過(guò)程中相互作用的分子機(jī)制；并用小鼠感染模型和目標(biāo)器官的iPSC衍生的器官中驗(yàn)證了其dú tè療效，這代表著未來(lái)SFTSV治療干預(yù)中潛在的有效和安全治療選擇。

預(yù)發(fā)表期刊：SSRN

樣本類型：細(xì)胞模型、小鼠模型、類器官

研究手段：Lip-MS、DARTS、SPR、BLI、分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬，百泰派克提供Lip-MS及質(zhì)譜檢測(cè)。

研究結(jié)果：

1、篩選潛在的抗SFTSV化合物

利用優(yōu)化的細(xì)胞感染模型，篩選了包含1400個(gè)小分子的FDA批準(zhǔn)文庫(kù)，在每個(gè)藥物濃度為10 μM的條件下，評(píng)估其潛在的抗SFSV活性，并據(jù)此進(jìn)一步闡明了優(yōu)化化合物的抗病毒作用和機(jī)制(圖1a)。

圖1 FDA批準(zhǔn)的抗SFTSV藥物化合物文庫(kù)的高通量篩選

初步篩選后，共有8個(gè)化合物在第二次平行篩選的中心濃度為10 μM時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病毒活性(抑制率大于95%)(圖1b)。其中BPQ在Huh7及THP-1、Vero和Raw264.7中表現(xiàn)出最佳的療效和低細(xì)胞毒性(圖1c-d)。

圖1 BPQ表現(xiàn)出最佳的療效和低細(xì)胞毒性

2、BPQ最有可能在內(nèi)化后過(guò)程中抑制病毒進(jìn)入

為了解BPQ對(duì)SFTSV的抗病毒作用，先設(shè)計(jì)了Huh7被病毒感染不同時(shí)間后受BPQ處理，結(jié)果表明，BPQ在0-4h內(nèi)顯著抑制SFTSV感染，尤其是在0-2小時(shí)(圖2a)。之前研究表明，SFTSV的復(fù)制周期為5 h，因此推測(cè)BPQ可能在病毒感染的早期階段，即病毒進(jìn)入階段，發(fā)揮抗病毒作用，并且發(fā)現(xiàn)0.08 μM BPQ處理對(duì)SFTSV幾乎沒(méi)有毒力（圖2b）。

隨后，檢測(cè)了BPQ對(duì)病毒結(jié)合和內(nèi)化（病毒粒子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中）的影響。文章將Huh7與SFTSV和BPQ或載體在4℃共孵育1.5 h，然后去除游離病毒顆粒，用RT-qPCR檢測(cè)結(jié)合病毒，結(jié)果顯示BPQ不影響SFTSV結(jié)合過(guò)程（圖2c）；之前研究表明SFTSV通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑內(nèi)化，這與文章結(jié)果一致，即在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用抑制劑pitstop 2 （PP2）存在時(shí)，SFTSV感染被抑制，而不是小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用或Filipin III或amiloride的微胞吞作用抑制劑（圖2d），為了確定BPQ是否阻礙SFTSV內(nèi)化，本實(shí)驗(yàn)使用熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)鐵蛋白（TF，由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化的經(jīng)典分子），結(jié)果表明BPQ處理沒(méi)有改變TF的攝取，而PP2顯著降低細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記的TF，表明BPQ也沒(méi)有阻礙SFTSV內(nèi)化（圖2e）。

圖2 BPQ對(duì)SFTSV侵襲早期的影響

3、BPQ干擾病毒膜融合過(guò)程，但不影響內(nèi)體酸化

在病毒內(nèi)化之后，SFTSV啟動(dòng)了膜融合過(guò)程。文章評(píng)估了BPQ對(duì)病毒膜融合的影響。先進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，以確定BPQ的抑制模式：分別用BPQ、bafilomycin A1、NH4Cl對(duì)感染的Huh7進(jìn)行不同時(shí)間的處理，BPQ表現(xiàn)出與bafilomycin A1和NH4Cl等gōng rèn的膜融合抑制劑相似的抑制模式，并且僅在病毒感染的初始階段發(fā)揮抗病毒活性，提示BPQ可能抑制病毒膜融合（圖3a）。

后面利用DiO標(biāo)記的SFTSV （SFTSVDiO）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)病毒-宿主細(xì)胞融合。熒光強(qiáng)度的增加的現(xiàn)象定義為膜融合，這是由于病毒粒子-宿主膜融合過(guò)程中DiO的稀釋而引起的猝滅。BPQ處理組與bafilomycin A1和NH4CI相比，熒光強(qiáng)度有明顯甚至更顯著的降低（圖3b-c）。由于膜融合的最后一步是融合孔的形成和內(nèi)體RNA的釋放，文章也研究了BPQ是否對(duì)它們有影響。用不同的化合物處理SFTSV感染的Huh7，然后用冷PBS和高鹽、高ph緩沖液chè dǐ清洗，使用洋地黃苷對(duì)細(xì)胞進(jìn)行滲透，使細(xì)胞質(zhì)成分（包含經(jīng)過(guò)wán quán膜融合的病毒釋放的RNA）擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)溶膠中，收集并檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)和膜組分，通過(guò)WB分析評(píng)估細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜分離效率，其中GAPD和Rab7分別代表細(xì)胞質(zhì)和膜組分（圖3d）。結(jié)果顯示，與膜融合抑制劑一致，BPQ顯著降低了胞內(nèi)體釋放的細(xì)胞質(zhì)病毒RNA水平（圖3e）。

研究證實(shí)，SFTSV 膜融合過(guò)程以pH依賴的方式發(fā)生在核內(nèi)體晚期，其中pH必須降低到約5.6才能觸發(fā)病毒糖蛋白重塑，暴露Gc蛋白融合環(huán)的活性位點(diǎn)。因此，文章檢測(cè)了BPQ對(duì)內(nèi)體酸化的影響。將SFTSV 感染的Huh7與化合物在37℃下孵育2 h，然后將上清替換為含有Lysotracker Deep Red試劑的新鮮培養(yǎng)基，以促進(jìn)細(xì)胞酸性細(xì)胞器的可視化。與bafilomycin A1和NH4Cl相比，BPQ和空白對(duì)照組的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差異（圖3f），表明BPQ不影響內(nèi)體酸化。

圖3 BPQ受損的SFTSV膜融合過(guò)程

4、大規(guī)模篩選與BPQ相互作用的靶蛋白-Lip-MS

為了闡明BPQ抑制SFTSV膜融合的具體機(jī)制，文章用SFTSV感染的Huh7裂解液與指定濃度的BPQ孵育，用Lip-MS篩選與BPQ相互作用的蛋白（圖4a）。與對(duì)照組相比，4 μM BPQ處理組共鑒定出2067個(gè)上調(diào)和1469個(gè)下調(diào)的DQPs，40 μM BPQ處理組鑒定出2171個(gè)上調(diào)和1425個(gè)下調(diào)的DQPs。然后根據(jù)BPQ濃度，采用分層聚類法分析DQP的定量變化（圖4c）。

DPQs的表達(dá)模式被分為4個(gè)簇，其中簇2和簇4的特征為增加模式，因?yàn)榕c對(duì)照組相比，在指定濃度的BPQ下，暴露肽的數(shù)量增加，這表明該化合物覆蓋了更多相關(guān)肽，保護(hù)它們免受蛋白酶裂解（圖4d）。最重要的是，4 μM BPQ處理組中有5個(gè)肽段和40 μM BPQ處理組中有3個(gè)肽段來(lái)自SFTSV Gc蛋白，該蛋白是SFTSV膜融合的關(guān)鍵病毒蛋白。此外，這5個(gè)多肽都在上調(diào)的暴露肽中（圖4b），其中2個(gè)遵循簇4模式。結(jié)合前期BPQ抑制SFTSV膜融合過(guò)程的結(jié)果，推測(cè)BPQ可能通過(guò)與病毒Gc蛋白相互作用抑制病毒感染。

圖4 Lip-MS分析大規(guī)模篩選與BPQ相互作用的靶蛋白

5、BPQ通過(guò)與病毒Gc直接相互作用抑制SFTSV膜融合過(guò)程

為了驗(yàn)證BPQ和Gc蛋白之間的潛在相互作用，文章進(jìn)行了藥物親和力響應(yīng)靶穩(wěn)定性（dart）測(cè)定。結(jié)果顯示，BPQ顯著抑制pronase對(duì)病毒Gc蛋白的蛋白水解，且呈劑量依賴性，提示BPQ可能與Gc結(jié)合（圖5a）。更重要的是，通過(guò)表面等離子體共振（SPR）和生物層干涉法（BLI）測(cè)定化合物與靶蛋白的結(jié)合親和力，均表明BPQ和Gc蛋白之間存在較強(qiáng)的直接相互作用。

分子對(duì)接推測(cè)BPQ與Gc蛋白之間潛在的相互作用。三維結(jié)構(gòu)模型表明，BPQ能夠滲透到蛋白口袋內(nèi)部，并與Gc II結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基形成廣泛的相互作用（圖5e）。BPQ與蛋白質(zhì)的結(jié)合能和對(duì)接分?jǐn)?shù)分別為-56.26 kcal/mol和-7.186，表明有較強(qiáng)的相互作用。在Lip-MS檢測(cè)中，一個(gè)上調(diào)的DQP(K631-R641)（圖5e所示的粉色肽）位于BPQ- Gc binding區(qū)域，形成疏水相互作用和靜電相互作用（圖5e）。結(jié)構(gòu)域II對(duì)于Gc的生物學(xué)功能至關(guān)重要，因?yàn)樗?fù)責(zé)介導(dǎo)膜融合的融合環(huán)。通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬（MDS）技術(shù)進(jìn)一步評(píng)價(jià)了BPQ與Gc的結(jié)合相對(duì)穩(wěn)定。

圖5 BPQ與病毒Gc蛋白的相互作用

6、BPQ在體內(nèi)對(duì)SFTSV全身感染具有保護(hù)作用

文章對(duì)BPQ的體內(nèi)抗病毒活性也進(jìn)行了評(píng)價(jià)。文章采用干擾素受體缺陷型（A129-/-）小鼠模型（該模型是經(jīng)驗(yàn)證的致死性SFTSV感染模型）。結(jié)果顯示，感染前24 h用BPQ處理小鼠，存活率提高了約30%（圖6a），存活小鼠的體重均逐漸恢復(fù)到正常水平（圖6b）。BPQ治療還顯著緩解了疾病發(fā)展早期的血小板減少癥（圖6c），這是SFTSV嚴(yán)重程度的關(guān)鍵指標(biāo)。此外，BPQ治療后，在整個(gè)感染過(guò)程中，脾臟、肝臟、結(jié)腸等靶器官的病毒載量也顯著降低（圖6d、圖6e、圖6f）。同樣，免疫熒光也證實(shí)了脾臟SFTSV感染的減少（圖6g），組織病理學(xué)分析顯示BPQ處理小鼠的病理?yè)p傷較輕，脾臟白色髓wěi suō減輕（圖6h）。

文章也用C57BL/6小鼠模型評(píng)估了BPQ的保護(hù)作用。C57BL/6小鼠在疾病早期表現(xiàn)出典型的血小板減少和SFTSV器官感染的臨床癥狀。BPQ處理減輕了感染小鼠的血小板減少（圖6i）的情況；脾臟的病毒載量和蛋白表達(dá)（圖6j和圖6k）也減少；通過(guò)組織病理學(xué)分析，脾臟出現(xiàn)了較輕的病理性損傷（圖6l）。結(jié)果表明BPQ在體內(nèi)對(duì)SFTSV感染具有一定的保護(hù)作用。

圖6 BPQ在SFTSV感染的A129?/?和C57BL/6小鼠中的表現(xiàn)出抗病毒活性

7、BPQ對(duì)人類來(lái)源的肝臟和結(jié)腸類器官具有有效的抗病毒活性

文章將成熟且質(zhì)量合格的肝臟和結(jié)腸類器官在指定濃度的BPQ存在下37℃用SFTSV孵育24小時(shí)，后回收類器官，采用全掛載免疫熒光染色法檢測(cè)病毒核蛋白（NP）的感染情況。結(jié)果表明，BPQ在成熟的人肝臟類器官中以劑量依賴的方式抑制SFTSV感染，這一點(diǎn)通過(guò)檢測(cè)白蛋白（ALB）水平得到證實(shí)（圖7a）。BPQ濃度為4 μM時(shí)，對(duì)結(jié)腸類器官的抗病毒作用更為明顯，幾乎檢測(cè)不到病毒NP；結(jié)腸特異性標(biāo)記物SATB2在感染后大量減少，提示病毒與宿主因子之間可能存在相互作用（圖7b）。

圖7 BPQ在SFTSV感染的人iPSC衍生的肝臟和結(jié)腸類器官中的抗病毒活性

研究結(jié)論：

SFTSV感染的新出現(xiàn)和不斷上升的發(fā)病率促使開(kāi)發(fā)新型有效、安全的抗SFTSV藥物。在本研究中，

shǒu cì發(fā)現(xiàn)抗寄生蟲(chóng)藥物BPQ具有低毒性、高抗病毒活性。體外實(shí)驗(yàn)表明，BPQ通過(guò)與病毒Gc蛋白直接相互作用抑制SFTSV感染，從而干擾病毒進(jìn)入期的膜融合過(guò)程。BPQ對(duì)感染小鼠也表現(xiàn)出最佳的保護(hù)作用，可使免疫缺陷小鼠的存活率提高約30%并觀察到BPQ對(duì)人類iPSC衍生的肝臟和結(jié)腸類器官病毒感染的抑制效果令人滿意，顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。

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