一、背景

化學(xué)發(fā)光法生物素檢測(cè)試劑盒(Chemiluminescent Biotin-labeled Nucleic Acid Detection Kit)是一種通過Streptavidin-HRP及后續(xù)的BeyoECL Star試劑來實(shí)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)Biotin標(biāo)記核酸的檢測(cè)試劑盒。適用于Southern blot、Northern blot、ribonuclease protection assay(RPA)或EMSA等實(shí)驗(yàn)中，采用生物素標(biāo)記的DNA或RNA探針時(shí)的檢測(cè)。本試劑盒不適用于生物素標(biāo)記蛋白的檢測(cè)。

化學(xué)發(fā)光法生物素標(biāo)記核酸檢測(cè)試劑盒同時(shí)還提供了封閉液、洗滌液等檢測(cè)時(shí)所需的配套試劑。化學(xué)發(fā)光法生物素標(biāo)記核酸檢測(cè)試劑盒采用了高質(zhì)量的Streptavidin-HRP Conjugate，HRP和Streptavidin共價(jià)交聯(lián)的比例大于3，這樣比采用Streptavidin和Biotin-HRP conjugate兩種試劑進(jìn)行檢測(cè)要更方便，并且靈敏度更高?；瘜W(xué)發(fā)光法生物素標(biāo)記核酸檢測(cè)試劑盒采用了非特異性結(jié)合比avidin更低的strepatavidin，使檢測(cè)結(jié)果背景更低靈敏度更高?；瘜W(xué)發(fā)光法生物素標(biāo)記核酸檢測(cè)試劑盒沒有提供生物素探針標(biāo)記相關(guān)的試劑，生物素標(biāo)記的DNA探針或EMSA探針的制備可以相應(yīng)地使用生物素3'末端DNA標(biāo)記試劑盒或EMSA探針生物素標(biāo)記試劑盒。

二、使用說明

1、在使用Biotin標(biāo)記探針的情況下，完成Southern、Northern雜交及后續(xù)洗滌后，或RPA的轉(zhuǎn)膜和交聯(lián)后，或EMSA的轉(zhuǎn)膜和交聯(lián)后，可以使用本試劑盒開始檢測(cè)。下面的檢測(cè)過程中溶液的用量是用于一片10x10cm膜的量。如果膜較大或較小，各溶液的用量可以按比例放大或縮小。

2、37-50℃水浴溶解封閉液和洗滌液。

3、取一合適的容器加入15ml封閉液，再放入交聯(lián)過的含有樣品的尼龍膜。在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動(dòng)15分鐘。

4、取5微升Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封閉液中(1:3000稀釋)，混勻備用。

5、去除封閉液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封閉液。在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動(dòng)15分鐘。

6、取25ml洗滌液(5X)，加入100ml重蒸水或MilliQ級(jí)純水，混勻配制成125ml洗滌液。

7、將尼龍膜轉(zhuǎn)移至另一裝有15-20ml洗滌液的容器內(nèi)，漂洗1分鐘。

8、去除洗滌液，加入15-20ml洗滌液，在側(cè)擺搖床或水平搖床緩慢上洗滌5分鐘。

9、重復(fù)步驟8三次(共洗滌四次)，每次洗滌時(shí)間均約為5分鐘。

10、將尼龍膜轉(zhuǎn)移至另一裝有20-25ml檢測(cè)平衡液的容器內(nèi)，在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動(dòng)5分鐘。

11、取5ml ECL Reagent A和5ml ECL Reagent B混勻，配制成ECL Reagent工作液。

12、取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。立即將膜的樣品面向上，放置到處于水平桌面上的潔凈容器內(nèi)或保鮮膜上。

13、在尼龍膜的表面小心加上步驟11配制好的共10ml ECL Reagent工作液，使工作液覆蓋尼龍膜。室溫放置2-3分鐘。

14、取出尼龍膜，用吸水紙吸去過多液體。將尼龍膜放在兩片保鮮膜或其它適當(dāng)?shù)耐腹獗∧ぶ虚g，并固定于壓片暗盒(也稱片夾)內(nèi)。

15、用X光片壓片1-5分鐘?？梢韵葔浩?分鐘，立即顯影定影，然后根據(jù)結(jié)果再調(diào)整壓片時(shí)間；也可以直接分別壓片30秒、1、3、5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，然后一起顯影定影觀察結(jié)果。

三、應(yīng)用

用于基于納米磁分離和化學(xué)發(fā)光的肝炎分子檢測(cè)新技術(shù)研究：

以肝炎為檢測(cè)對(duì)象,結(jié)合化學(xué)發(fā)光和磁分離技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),建立了幾種快速、高通量、靈敏和實(shí)用的肝炎分子檢測(cè)新技術(shù)。具體內(nèi)容包括：

1、功能化磁性納米顆粒的制備及在核酸提取中應(yīng)用為提高磁性納米顆粒功能化結(jié)合分子檢測(cè)探針量,本章在進(jìn)行乙肝樣本高靈敏檢測(cè)研究前對(duì)傳統(tǒng)功能化磁性納米顆粒的制備方法進(jìn)行了改進(jìn),首先采用軟模板法制備Fe304磁性納米顆粒,并進(jìn)行包被SiO2實(shí)驗(yàn)。包被前平均直徑為500 nm,且為圓顆粒,大小比較均一,具有超順磁性,飽和磁化強(qiáng)度為1.7374emu/g,制備的包被SiO2復(fù)合Fe3O4顆粒大小,平均粒徑為700nm,制備后的Fe3O4@SiO2具有明顯的核殼結(jié)構(gòu),具有較好的分散性,顆粒為圓形,大小均一。將磁性納米顆粒應(yīng)用于細(xì)菌和全血樣本核酸提取中均獲得良好的提取效果,有望開發(fā)出磁珠分離法核酸提取試劑盒。

2、基于功能化磁性納米顆粒的肝炎核酸分子提取及擴(kuò)增首先針對(duì)不同來源的兩種乙肝核酸提取方法提取效果進(jìn)行比較分析,并對(duì)提取出來的乙肝核酸樣品進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清肝炎病毒核酸提取量雖少,但可以應(yīng)用于PCR擴(kuò)增,而應(yīng)用于全基因組擴(kuò)增效果較差。與此同時(shí),全血中核酸提取量較高,一方面可以用于PCR擴(kuò)增,還可應(yīng)用于全基因組擴(kuò)增技術(shù),這樣就起到了對(duì)肝炎核酸分子富集放大的作用。經(jīng)過全基因組擴(kuò)增的全血乙肝核酸DNA還可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本章還對(duì)全血乙肝核酸DNA的全基因組擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化分析,這為今后利用化學(xué)發(fā)光的高通量多樣本測(cè)定乙肝分子檢測(cè)打下了基礎(chǔ)。

3、基于納米磁分離和化學(xué)發(fā)光的乙肝PCR擴(kuò)增檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化本章以生物素標(biāo)記的乙肝HBV DNA為目標(biāo)分子,建立了一種乙肝核酸分子的化學(xué)發(fā)光雜交檢測(cè)方法,結(jié)果表明,該方法的特異性較好。通過對(duì)檢測(cè)體系中涉及到的多種實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化處理,對(duì)整個(gè)檢測(cè)方法有了更深入的了解,并得出了化的實(shí)驗(yàn)條件,有望提高該方法的檢測(cè)靈敏度。

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