凝膠色譜儀如何解析蛋白純度與聚集體

來源：上海杜凱生物科技有限公司 2025年04月16日 17:50

　　凝膠色譜儀（GPC/GFC）是蛋白質(zhì)純度分析與聚集體檢測的核心工具，其核心原理基于分子篩效應(yīng)：大分子因無法進(jìn)入凝膠孔隙而快速流出，小分子則因深入孔隙而延遲洗脫，從而實現(xiàn)分子量依賴的分離。以下是具體解析方法：

　　一、蛋白純度分析

　　分離機制

　　使用葡聚糖（Sephadex）或瓊脂糖（Sepharose）填料構(gòu)建凝膠柱，流動相為低離子強度緩沖液（如PBS）。

　　目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)（如宿主細(xì)胞蛋白、核酸）因分子量差異被分離，純蛋白在單一峰中洗脫，雜質(zhì)形成肩峰或拖尾。

　　純度評估

　　峰面積積分：通過紫外檢測器（UV280nm）計算目標(biāo)蛋白峰面積占比，純度=目標(biāo)峰面積/總面積×100%。

　　標(biāo)準(zhǔn)品對比：與已知純度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（如BSA）共跑，對比保留時間與峰形一致性。

　　二、聚集體檢測

　　聚集體形成機制

　　蛋白質(zhì)在儲存、運輸或高溫條件下易發(fā)生二硫鍵交換、疏水相互作用，形成二聚體、寡聚體甚至可溶性聚集體。

　　檢測方法

　　多角度光散射（MALS）聯(lián)用：實時監(jiān)測分子量變化，聚集體表現(xiàn)為保留時間提前且分子量顯著增大（如單體50kDavs二聚體100kDa）。

　　峰形分析：聚集體導(dǎo)致峰形不對稱（前延或拖尾），通過第二維分析（如SEC-MALS）可定量聚集體比例。

　　案例

　　某單抗藥物在40℃儲存后，凝膠色譜圖顯示主峰前出現(xiàn)肩峰，MALS檢測到20%二聚體，證實高溫導(dǎo)致聚集。

　　三、技術(shù)優(yōu)化

　　柱效提升：使用小粒徑填料（如3μm）提高分辨率，縮短分析時間至15分鐘。

　　溶劑兼容性：選擇pH耐受范圍廣的凝膠（如Superdex200Increase），避免蛋白變性。

　　自動化：結(jié)合液相色譜系統(tǒng)（如AKTA），實現(xiàn)梯度洗脫與在線濃度監(jiān)測。

　　凝膠色譜儀通過分子量依賴的分離機制，可直觀解析蛋白純度與聚集體水平，為生物制藥質(zhì)量控制提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)支持。

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