植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長情況和活力水平直接影響地上部的生長和營養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。本實驗練習(xí)測定根系活力的方法，為植物營養(yǎng)研究提供依據(jù)。

氯化三苯基四氮唑（TTC）是標(biāo)準(zhǔn)氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶于水中成為無色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲瓚，生成的三苯甲瓚比較穩(wěn)定，不會被空氣中的氧自動氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗的氫受體，植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標(biāo)。

操作步驟：

建議正式實驗前選取2個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗樣本和試劑浪費！

1、預(yù)實驗樣本制備

將根部組織洗凈，去除根上的泥土，輕輕擦干，不要過分?jǐn)D壓破壞根系細(xì)胞。

2、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

① 臨用前取 10μL 10mg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)液，加入1990μL試劑二，充分混勻，配制成 50μg/mL TTC標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。（后續(xù)實驗需要1000μL，為減小實驗誤差，故配制大體積。）

② 取 1mL 50 μg/mL TTC 標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到一支試劑三內(nèi)，充分震蕩混勻2min?；靹蚝蠹尤?1mL 乙酸乙酯，再次充分震蕩混勻2min，室溫靜置分層5min，取上層溶液。

③ 將上層溶液用乙酸乙酯進行稀釋，得到20μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用（吸取200μL 50μg/mL TTC加入300μL乙酸乙酯混勻即可）。

3、預(yù)實驗上機操作：

① 酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至485nm。

② 標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定：取 200μL 20μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和200μL乙酸乙酯（即0μg/mL）于96孔板(非聚苯乙烯材質(zhì))中，分別測定其在485nm處的吸光度，分別記為A標(biāo)準(zhǔn)管、A空白管。計算ΔA標(biāo)準(zhǔn)= A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。ΔA標(biāo)準(zhǔn)只需做1-2次。

③ 操作表：

4、正式實驗：

① 若樣品 37℃暗反應(yīng)未到4h但根系已出現(xiàn)深粉色，此時可以直接進行下一步實驗操作；若ΔA測定大于1.5，可以減少樣本質(zhì)量或者縮短反應(yīng)時間進行實驗，計算公式注意修改；

② 若4h暗反應(yīng)結(jié)束后，根系沒有出現(xiàn)粉色或者ΔA測定小于0.005，可以延長暗反應(yīng)時間（8h，16h甚至24h）或者加大樣品量，計算公式注意修改。

③ 確定好最適實驗條件后，正式實驗樣本制備同預(yù)實驗樣本制備；

④ 正式實驗按照預(yù)實驗上機操作步驟進行（標(biāo)準(zhǔn)管和空白管預(yù)實驗已做，正式實驗可選做）。

五、結(jié)果計算：

按照樣本質(zhì)量計算根系活力：以TTC的還原量來表示根系活力：

TTC還原強度[ μg TTC/(g·h)] =ΔA測定×C標(biāo)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V÷(W×T)

=5×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

W：根重，g； C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，20μg/mL；

T：反應(yīng)時間，4h； V：試劑五的體積即勻漿體積，1mL。

注意事項：

1、試劑五容易揮發(fā)，有毒，為了您的健康，請穿實驗服，戴口罩，戴乳膠手套操作。

2、如果離心后待測的上清依然渾濁，可嘗試加大離心轉(zhuǎn)速或者延長時間，例如15000rpm 4℃離心 20min。