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實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀主要由熒光定量系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀主要由熒光定量系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成。熒光定量系統(tǒng)負(fù)責(zé)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過程中的熒光信號(hào)，而計(jì)算機(jī)則負(fù)責(zé)收集、處理和分析這些熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實(shí)時(shí)分析軟件以圖表的形式顯示，原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對(duì)于循環(huán)數(shù)的圖表，便于后續(xù)的分析和解讀。
其工作原理基于在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光標(biāo)記探針。這些熒光物質(zhì)能夠隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行而發(fā)出熒光信號(hào)，其強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量成正比。在PCR反應(yīng)過程中，儀器通過熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)測(cè)量熒光信號(hào)強(qiáng)度，從而監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增的進(jìn)程。
具體來說，PCR反應(yīng)包括變性、退火和延伸三個(gè)步驟。在變性步驟中，DNA雙鏈被打開成單鏈；在退火步驟中，特異性引物與模板DNA的單鏈結(jié)合；在延伸步驟中，DNA聚合酶沿著引物延伸，合成新的DNA鏈。這三個(gè)步驟在PCR儀中通過準(zhǔn)確控制溫度來實(shí)現(xiàn)循環(huán)進(jìn)行，每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增的產(chǎn)物量呈指數(shù)增長。
根據(jù)所用熒光物質(zhì)的化學(xué)原理和PCR檢測(cè)的特異性，可將實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀分為兩大類：DNA染料法和熒光探針法。
1.DNA染料法：如SYBR Green I等熒光染料可以快速滲入DNA雙鏈與之結(jié)合，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入雙鏈的熒光染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，可以對(duì)特異性和非特異性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。這種方法可檢測(cè)所有雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，包括非特異反應(yīng)產(chǎn)物，如引物二聚體，不需要探針，因此減少了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及運(yùn)轉(zhuǎn)成本，適合于大量基因的分析，但缺點(diǎn)是易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象。
2.熒光探針法：可分為Taqman探針法和分子信標(biāo)探針法。Taqman探針法是在PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)，再加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)正好被淬滅基團(tuán)吸收，體系中沒有光信號(hào)；隨著反應(yīng)的進(jìn)行，探針被Taq酶的5'-3外切酶酶切降解，使報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)接收熒光信號(hào)。分子信標(biāo)是種由于堿基互補(bǔ)形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，由于熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)靠得很近，熒光被淬滅。PCR擴(kuò)增過程中隨著DNA雙鏈解鏈，信標(biāo)的莖環(huán)與暴露的DNA靶序列雜交，互補(bǔ)區(qū)被拉開致使熒光基團(tuán)和泮滅基團(tuán)之間距離增加，熒光恢復(fù)。
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