什么是文庫(kù)制備？在待測(cè)片段兩端連接特定接頭從而使其符合測(cè)序平臺(tái)要求的過(guò)程。Illumina 芯片F(xiàn)lowcell(流動(dòng)池)是有著8個(gè)lane(泳道)的玻璃板，每個(gè)lane可以測(cè)一個(gè)樣本或者多樣本的混合物，且隨機(jī)布滿了能夠與文庫(kù)兩端接頭分別互補(bǔ)配對(duì)或一致的寡核苷酸(oligos，P7和P5接頭)，一個(gè)lane包含兩列，每一列有60個(gè)tile（每條lane有120個(gè)格子），每個(gè)tile有很多個(gè)凹坑，會(huì)種下不同的cluster（蔟），每個(gè)tile在一次循環(huán)中會(huì)拍照4次(每種堿基一次)，一次反應(yīng)cycle在每條lane拍120張照片。Illumina 文庫(kù)：基于TA連接P5/P7：和芯片上的oligos（P5‘/P7’）可以互補(bǔ)，目的是讓文庫(kù)接到芯片上。Index：標(biāo)簽，也叫Barcode，因?yàn)橐粋€(gè)lane可以同時(shí)測(cè)多個(gè)樣品，給每個(gè)樣本帶個(gè)帽子，測(cè)序后可以區(qū)分誰(shuí)是誰(shuí)的。接頭連接：利用TA克隆在DNA片段兩端加上能夠與測(cè)序儀配合的接頭序列。DNA建庫(kù)流程：DNA片段化、接頭連接、連接產(chǎn)物純化、PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、文庫(kù)長(zhǎng)度分選片段化由于目前市場(chǎng)中NGS測(cè)序儀的測(cè)序長(zhǎng)度通常在 150-550bp 之間，因此需要使用機(jī)械打斷或酶切打斷的方法將大片段基因組DNA片段化為小片段的DNA。片段化酶是隨機(jī)內(nèi)切酶，不受特定酶切位點(diǎn)的限制，隨機(jī)切割對(duì)應(yīng)模板DNA，片段化的產(chǎn)物屬于粘性末端，后續(xù)需要進(jìn)行末端修復(fù)。酶切形成兩條單鏈末端時(shí)，產(chǎn)生末端的核苷酸順序不是平齊的，稱(chēng)為粘性末端；產(chǎn)生核苷酸順序平齊的末端，則稱(chēng)為平末端。