隨著流式分析、細(xì)胞分選、單細(xì)胞組學(xué)、質(zhì)譜流式等研究技術(shù)的蓬勃發(fā)展，單細(xì)胞也在腫瘤免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域成為大眾的焦點(diǎn)，它能夠很好地反映細(xì)胞的特異性和異質(zhì)性。目前，組織（以腫瘤組織為例）制備成單細(xì)胞懸液的方法主要有機(jī)械解離法、酶解法和化學(xué)法（圖1）。

圖1 腫瘤組織制備成單細(xì)胞懸液的方法[1]

高質(zhì)量的初始樣本是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。然而如何在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化粗懸液，獲得高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液呢？基于三者的原理以及適用范圍等（表1），我們發(fā)現(xiàn)這些方法處理樣本時(shí)，沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。就機(jī)械法來(lái)說(shuō)，每次實(shí)驗(yàn)研磨的力道稍有不同，對(duì)細(xì)胞造成的損傷也不一樣，這樣就很難保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。不僅如此，處理樣本的過(guò)程中，細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)“死亡、碎片化、粘連”的情況，甚至某些組織如脾臟、心臟等還存在“紅細(xì)胞”這一干擾因素。

表1 組織制備單細(xì)胞懸液方法的區(qū)別

針對(duì)這些問(wèn)題，我們“對(duì)癥下藥”，單細(xì)胞懸液質(zhì)量?jī)?yōu)化的神兵利器主要有以下五種：

1、gentleMACS Dissociator：gentleMACS全自動(dòng)組織溫和處理器可快速、溫和、安全、自動(dòng)、便捷和標(biāo)準(zhǔn)化地將組織（如脾臟、肝臟、腫瘤、表皮等）處理成單細(xì)胞懸液，可謂是組織樣本處理的絕好幫手。其包含全自動(dòng)組織解離器、zhuan利解離管和針對(duì)不同組織優(yōu)化的解離試劑盒，以及預(yù)設(shè)軟件程序在內(nèi)的整體方案，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同組織樣本的優(yōu)化解離，確保細(xì)胞的活力、功能和表面表位的完好。能夠確保每一次解離都在優(yōu)化條件，同時(shí)解放雙手，結(jié)果也可以輕松重復(fù)。

2、預(yù)分離：粗懸液中的細(xì)胞團(tuán)塊會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的不wan全標(biāo)記或增加非特異性結(jié)合標(biāo)記而分離得到許多非目的細(xì)胞。不僅如此，在一些后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞團(tuán)塊也會(huì)影響細(xì)胞的最佳狀態(tài)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，我們可以在粗懸液制備后對(duì)其進(jìn)行預(yù)分離，利用細(xì)胞濾器或篩網(wǎng)等，去除粗懸液中的細(xì)胞團(tuán)塊。

3、死細(xì)胞去除：在二代測(cè)序，細(xì)胞分選等下游實(shí)驗(yàn)中，死細(xì)胞將影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性。死亡的細(xì)胞易裂解導(dǎo)致其中的RNA釋放出來(lái)，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)的背景噪聲，進(jìn)而影響單細(xì)胞數(shù)據(jù)的質(zhì)量。此外，在細(xì)胞分選中，死細(xì)胞會(huì)影響捕獲細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，不利于下游的細(xì)胞培養(yǎng)和功能驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)。需要注意的是，當(dāng)細(xì)胞活率<30%時(shí)，不建議進(jìn)行此項(xiàng)操作，去除死細(xì)胞后，細(xì)胞活率雖然達(dá)到90%以上，但大部分細(xì)胞都已經(jīng)死亡，細(xì)胞類型及分群會(huì)改變。

圖2 經(jīng)熱休克處理的外周血單核細(xì)胞（PBMC）死細(xì)胞去除前后細(xì)胞分群比較[2]

4、去除碎片：機(jī)械解離的研磨，酶解法的吹打，甚至是離心過(guò)程，都可能會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞碎片。樣本制備過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞團(tuán)、細(xì)胞碎片等會(huì)增加微流體芯片的堵塞風(fēng)險(xiǎn)，也會(huì)增加流式等實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的非特異性標(biāo)記。我們可以通過(guò)嚴(yán)格控制上述操作的精度和力度來(lái)減少細(xì)胞碎片（難度較大），也可以使用細(xì)胞碎片去除試劑盒來(lái)優(yōu)化（方便快捷）。

圖3 成年大鼠心臟組織單細(xì)胞懸液去除碎片前后細(xì)胞群比較[2]

5、紅細(xì)胞裂解：諸如脾臟、心臟、肝臟等制備單細(xì)胞懸液都會(huì)涉及到紅細(xì)胞的裂解。紅細(xì)胞過(guò)多會(huì)導(dǎo)致有效細(xì)胞識(shí)別不準(zhǔn)確、有效細(xì)胞-非細(xì)胞界限模糊、有核率低等問(wèn)題。

圖4 成年大鼠心臟組織單細(xì)胞懸液（已去除碎片）進(jìn)行紅細(xì)胞裂解前后比較[2]

相信有了這些法寶，小伙伴們一定能夠獲得高質(zhì)量單細(xì)胞懸液（表2），順利開展實(shí)驗(yàn)啦!

表2 高質(zhì)量單細(xì)胞懸液質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

文中相關(guān)產(chǎn)品：

資料來(lái)源：

[1] Mitra A, Mishra L, Li S. Technologies for deriving primary tumor cells for use in personalized cancer therapy. Trends Biotechnol. 2013 Jun;31(6):347-54.

[2]美天旎