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質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑的相關(guān)知識(shí)點(diǎn)介紹
轉(zhuǎn)染(transfection)是細(xì)胞在一定條件下主動(dòng)或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過(guò)程。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)于哺乳細(xì)胞蛋白的表達(dá)至關(guān)重要，轉(zhuǎn)染的方法和步驟直接影響著轉(zhuǎn)染的成功與否。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑適用于24孔板培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所有數(shù)量和體積均是按孔計(jì)算。大部分細(xì)胞系所使用的DNA(μg)與VigeneFection(μg)的比值為1:3或1:4，轉(zhuǎn)染狀態(tài)良好的細(xì)胞可獲得高轉(zhuǎn)染效率、高表達(dá)水平和低細(xì)胞毒性。轉(zhuǎn)染步驟：
1、貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天每孔0.5-2×105個(gè)細(xì)胞接種于500μl培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞可長(zhǎng)至90-95%融合。
懸浮細(xì)胞：在配制轉(zhuǎn)染液前每孔4-8×105個(gè)細(xì)胞接種于500μl培養(yǎng)基中。
2、轉(zhuǎn)染液制備，每孔細(xì)胞用量如下：
A. 用50μlDMEM培養(yǎng)基(或者其他無(wú)血清培養(yǎng)基)稀釋質(zhì)粒DNA，輕輕混勻。
B. 取適量VigeneFection 在50μl DMEM培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育5min。
C. 將前兩步所稀釋的DNA和VigeneFection 混合，輕輕混勻，室溫放置30min。
3、在每孔細(xì)胞中加入混合后的轉(zhuǎn)染液，輕輕搖勻。
4、貼壁細(xì)胞可在轉(zhuǎn)染4-6h后可更換培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞可在轉(zhuǎn)染后的18-48h之間，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液。轉(zhuǎn)染18-48h之后可檢測(cè)基因表達(dá)。如果檢測(cè)到蛋白表達(dá)，請(qǐng)?jiān)谵D(zhuǎn)染后24-72h收集培養(yǎng)液。
5、對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染24h后以1:10傳代培養(yǎng)，第二天可加入選擇培養(yǎng)基。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑將外源核酸片段導(dǎo)入細(xì)胞，影響內(nèi)源基因表達(dá)水平。在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑，例如在綿羊成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)程中FuGene HD的轉(zhuǎn)染效率更高，GenEscortTM I對(duì)小鼠膠質(zhì)細(xì)胞則具有更好的轉(zhuǎn)染效果?？傊?，可以遵循低毒等原則進(jìn)行選擇。在一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率與質(zhì)粒/轉(zhuǎn)染試劑比值成正相關(guān)，但毒性也會(huì)增加?？梢愿鶕?jù)轉(zhuǎn)染試劑推薦比例確定合適的合適的轉(zhuǎn)染比例。
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