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高效液相（HPLC）色譜柱五大誤解

來源：大連凱美化工工程配套有限公司 2022年07月26日 15:41

使用填充較小顆粒的色譜柱，總能獲得更高的效率

假。盡管對于填充良好的色譜柱，隨著填充色譜柱中顆粒平均直徑的減小，效率會(huì)提高，但如果柱外對特定HPLC硬件系統(tǒng)的譜帶擴(kuò)寬的貢獻(xiàn)足夠高，則該色譜柱的全部性能將無法獲得被實(shí)現(xiàn)。柱外成分包括填料本身以外的所有其他體積。這些貢獻(xiàn)包括以下內(nèi)容：

進(jìn)樣量包括回路尺寸以及進(jìn)樣閥內(nèi)的其他體積。
從進(jìn)樣器出口到色譜柱入口的油管容積。
保護(hù)柱間隙的體積，包括端接頭（如果有）。
在線過濾器體積（如果有）。
入口色譜柱接頭內(nèi)的內(nèi)部容積包括多孔篩板和流動(dòng)通道。
色譜柱的體積。
底部色譜柱接頭內(nèi)的內(nèi)部容積包括多孔篩板和流動(dòng)通道。
從色譜柱出口到檢測器入口的油管容積。
流通池之前的檢測器內(nèi)的管道容積。
流通池體積。

所有這些體積的方差都是累加的。因此，可以程度地減少進(jìn)樣量并使色譜柱入口管的長度短，內(nèi)徑小，但如果從色譜柱出口到檢測器的連接管有1 m，則譜帶展寬可能足夠大影響分離的整體效率。因此，如果您希望獲得1.8 μm HPLC色譜柱或內(nèi)徑為1.0 mm的色譜柱的預(yù)期效率，請確保將柱外效應(yīng)降至低。

誤解2

對于硅膠填料，殘留的硅烷醇導(dǎo)致拖尾峰

假。在某些情況下，存在于所有基于硅膠的鍵合相色譜柱上的硅烷醇會(huì)引起拖尾，特別是對于堿性化合物而言。這種拖尾歸因于硅烷醇基團(tuán)是一種弱酸，pKa約為4.5-4.7。因此，當(dāng)流動(dòng)相的pH值接近4-5時(shí)，硅烷醇被離子化，并可以通過靜電吸引作用與帶正電的分子（如質(zhì)子化的胺）相互作用。通過將pH值降至3以下來抑制硅烷醇的離子化，可以大程度地減少這種相互作用。對于某些堿性化合物，有時(shí)在較低的pH值下會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。有專門設(shè)計(jì)的反相填料，可以為堿性化合物提供良好的峰形。

峰拖尾的三個(gè)基本原因：化學(xué)問題（其中一個(gè)已在前面討論過）；色譜柱填充問題和儀器硬件問題。這三個(gè)因素都可能導(dǎo)致峰拖尾，并且必須調(diào)查根本原因以確定補(bǔ)救措施。詳細(xì)討論這三個(gè)問題不在此問題的范圍內(nèi)，但是每種類型的一些示例將為您提供總體思路。首先，除了與硅烷醇的相互作用外，與化學(xué)有關(guān)的拖尾問題還可以通過幾種方式表現(xiàn)出來。金屬螯合化合物可與色譜柱填充物中的微量金屬發(fā)生相互作用，這對于較舊的二氧化硅材料尤為明顯。使用錯(cuò)誤的注射溶劑有時(shí)會(huì)導(dǎo)致拖尾。用比流動(dòng)相強(qiáng)得多的溶劑注入樣品會(huì)產(chǎn)生峰形失真。拖尾可能是由于色譜柱頂部強(qiáng)烈保留的樣品組分或流動(dòng)相雜質(zhì)造成的堆積材料引起的。這種材料可以充當(dāng)不同的固定相，從而導(dǎo)致相互作用的化合物出現(xiàn)拖尾問題。有時(shí)會(huì)出現(xiàn)混合模式，從而導(dǎo)致拖尾。在這里，溶質(zhì)可以通過反相和離子相互作用與活性基團(tuán)相互作用。有時(shí)，當(dāng)流動(dòng)相的pH值錯(cuò)誤并且樣品被部分電離時(shí)，所產(chǎn)生的峰可能會(huì)失真并且類似于拖尾。較大峰背面的部分共溶峰較小，有時(shí)看起來像拖尾。

色譜柱填充問題可能導(dǎo)致峰拖尾。色譜柱頂部的空隙會(huì)導(dǎo)致雙峰或峰拖尾。填料不充分的色譜柱可能會(huì)形成通道，導(dǎo)致峰形變差。如果色譜柱因樣品質(zhì)量過大而超載，則可能會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，盡管峰前沿更為普遍。在低進(jìn)樣質(zhì)量下，硅烷醇超載可能發(fā)生拖尾。

讓我們考慮一些可能會(huì)拖尾的儀器和硬件問題。拖尾可能是由柱外效應(yīng)和流路中其他未清掃的體積引起的。末端接頭或連接不正確造成的未清除體積可能會(huì)顯示為峰拖尾。來自進(jìn)樣器的壓力脈沖可能會(huì)導(dǎo)致色譜柱空隙，從而導(dǎo)致拖尾。緩慢的檢測器時(shí)間常數(shù)和快速洗脫的峰會(huì)導(dǎo)致峰展寬，有時(shí)類似于拖尾。在室溫下進(jìn)入的溶劑與較高的色譜柱操作溫度之間的熱不匹配也會(huì)導(dǎo)致峰變形。

因此，并非總是硅烷醇在HPLC中引起峰拖尾。

誤解3

硅膠填料只能在pH2-7范圍內(nèi)使用

假。通常，HPLC反相色譜柱的化學(xué)降解機(jī)理有兩種：pH值小于2時(shí)硅氧烷鍵的催化水解；液相色譜法。pH值大于7-8的氫氧根離子可溶解硅膠。這兩種現(xiàn)象已由Kirkland及其同事進(jìn)行了廣泛研究。在pH值小于2時(shí)，–Si-O-Si-（硅氧烷）鍵可被氫鍵（H3O +）裂解鍵合相攻擊，從而導(dǎo)致在有機(jī)的損失。隨著時(shí)間的流逝，保留率通常會(huì)隨著碳含量的降低而降低。對于短鏈封端部分，例如三甲基硅烷，尤其值得注意。較長的C18相由于其空間位阻而對下面的硅氧烷提供了一定的保護(hù)，但最終甚至?xí)艿角治g，尤其是在溫度高于環(huán)境溫度的情況下。有空間保護(hù)和緊密覆蓋的鍵合相，可幫助阻止鍵合相在硅膠上的裂解。聚合物相沒有顯示出這種不穩(wěn)定性，但是具有比基于二氧化硅的相效率低的缺點(diǎn)。

在高pH值方面，必須有某種方法來阻止下面的硅膠受到氫氧根離子的侵蝕。一旦發(fā)生溶解過程，色譜柱最終將失效，經(jīng)常會(huì)形成空隙。特殊色譜柱專為高pH操作而設(shè)計(jì)，包括二齒C18，雜化和聚合物涂層二氧化硅。這些相從化學(xué)上保護(hù)基礎(chǔ)材料免受氫氧化物的侵蝕。這些填料能夠承受11–12范圍內(nèi)的pH值。在此范圍內(nèi)操作時(shí)，大多數(shù)二氧化硅基填料應(yīng)避免高溫。當(dāng)然，聚合物相可以在高達(dá)13的pH值下操作，有時(shí)甚至達(dá)到14，但是，它們的缺點(diǎn)是效率低于二氧化硅基相。

因此，真正的答案是：特殊的硅膠鍵合相可以在pH值為2–7的區(qū)間之外操作，但應(yīng)注意使用常規(guī)的硅膠填料，尤其是在高溫下。

納譜分析

ChromCore系列液相色譜柱參數(shù)信息表

誤解4

現(xiàn)代HPLC色譜柱應(yīng)承受至少1000次進(jìn)樣

假！有許多因素可控制任何現(xiàn)代HPLC色譜柱可以承受的進(jìn)樣次數(shù)。

一些因素基于模式：反相、離子交換、體積排阻、正相、手性、親水性相互作用等。

其中一些因素取決于色譜柱中填料的類型，例如硅膠填料、雜化填料、氧化鋯填料或聚合物填料，或軟凝膠或樹脂的交聯(lián)度。

一些因素取決于鍵合相本身：覆蓋范圍、鍵的類型、聚合物相、單層或涂層相。

其他因素取決于操作條件：pH、溫度、流動(dòng)相成分、緩沖液組成、流速、壓力等。

還取決于所注入的樣品：僅標(biāo)準(zhǔn)樣品、樣品清潔度、樣品pH值、樣品體積、樣品中存在的雜質(zhì)、溶質(zhì)分子本身等。

如果濫用色譜柱，例如在超出其建議的pH限制或流速范圍內(nèi)使用色譜柱，則可能只會(huì)進(jìn)樣50次甚至更少。如果樣品簡單，沒有高度保留的雜質(zhì)，則色譜柱可承受5000次或更多次進(jìn)樣。如果色譜柱未在其上限處連續(xù)運(yùn)行，則使用壽命會(huì)更長。如果色譜柱受到各種樣品的影響，并且從未沖洗過以去除強(qiáng)烈保留的雜質(zhì)，那么它將縮短其壽命。

大多數(shù)人期望當(dāng)5 μm反相色譜柱用于分析配方，簡單藥物混合物和標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，至少要進(jìn)樣1000次。如果該色譜柱用于“臟樣品”，例如尚未*清除的生物液體提取物或環(huán)境提取物，則不應(yīng)期望進(jìn)行1000次進(jìn)樣。

因此，預(yù)期的進(jìn)樣次數(shù)不是固定的，而是取決于色譜柱的類型、操作條件、樣品清潔度和濫用程度。當(dāng)然，對于使用保護(hù)柱和在線過濾器，色譜柱壽命應(yīng)更長。許多色譜分析人員實(shí)際上并不知道每根色譜柱的使用壽命可獲得多少次進(jìn)樣。一些現(xiàn)代的HPLC儀器具有內(nèi)置的色譜柱模塊和軟件，可以使它們監(jiān)測進(jìn)樣次數(shù)。

誤解5

色譜柱應(yīng)始終蓋緊，以防止填料與大氣接觸

而損壞

假！通常，端接件上的小孔的直徑可能不大于0.02英寸，其橫截面面積很小，以至于空氣進(jìn)入填料和溶劑內(nèi)部的溶劑接觸會(huì)損壞色譜柱。色譜柱蒸發(fā)極少。即使有少量空氣進(jìn)入色譜柱，也可能很難擴(kuò)散通過微粒填充床并與足夠的填充材料接觸，從而產(chǎn)生不利影響。如果色譜柱中有少量空氣，則在下次將其安裝到HPLC儀器中并對其進(jìn)行泵送流動(dòng)相后立即對其加壓，則少量的空氣可能會(huì)在高壓下溶解或被沖洗掉。初始液體在短時(shí)間內(nèi)不會(huì)對以后的使用造成任何問題。但是，如果一定要通過封住端接裝置而感到更加安全，那就這樣做。大多數(shù)色譜柱配備了色譜柱接頭，可以擰緊這些螺帽，以防止存儲(chǔ)溶劑蒸發(fā)或空氣進(jìn)入填充床的任何可能性。

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