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利用飛行時(shí)間核酸質(zhì)譜定量檢測(cè)超微量樣本中核酸表觀修飾的新方法LAMP-MS

閱讀：189 發(fā)布時(shí)間：2025-3-28

2024年11月4日，國(guó)際化學(xué)類(lèi)頂級(jí)期刊《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)國(guó)際版》（Angewandte Chemie-international Edition）（IF 16.1）上發(fā)表了題為《LAMP-MS for Locus-Specific Visual Quantification of DNA 5mC and RNA m6A Using Ultra-Low Input》的研究論文。報(bào)道了一種基于核酸質(zhì)譜平臺(tái)的創(chuàng)新甲基化檢測(cè)方法，該工作由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院胡璐璐研究員團(tuán)隊(duì)、華山醫(yī)院消化科劉杰主任團(tuán)隊(duì)、美國(guó)芝加哥大學(xué)何川院士團(tuán)隊(duì)攜手柏锘（上海）醫(yī)療科技有限公司共同完成。

該研究中所使用的飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)為聚光科技生命科學(xué)板塊旗下聚致生物（GenWish）自主研發(fā)的GeneTOF 3100核酸質(zhì)譜分析系統(tǒng)。

利用飛行時(shí)間核酸質(zhì)譜定量檢測(cè)超微量樣本中核酸表觀修飾的新方法LAMP-MS

液體活檢技術(shù)通過(guò)收集血液中來(lái)自各種組織的游離DNA（cfDNA），對(duì)其中包含的生物標(biāo)志物（如基因突變、甲基化或羥甲基等表觀修飾）進(jìn)行檢測(cè)，具有無(wú)創(chuàng)、高效的特點(diǎn)。與傳統(tǒng)的各種檢測(cè)技術(shù)（例如胃腸鏡、血清標(biāo)志物）相比，液體活檢在臨床上具有革命性的優(yōu)勢(shì)，在癌癥等疾病的早篩早診、預(yù)后監(jiān)測(cè)、療效評(píng)估等諸多方面有廣闊的應(yīng)用前景。

DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，可在腫瘤發(fā)生的早期被檢測(cè)到，且具有較好的穩(wěn)定性，因此成為腫瘤液體活檢中一個(gè)生物標(biāo)志物。但是，目前基于亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)的甲基化檢測(cè)方法，很難避免DNA的降解；且高通量測(cè)序成本較高，實(shí)驗(yàn)后的分析工作復(fù)雜；PCR檢測(cè)涵蓋的位點(diǎn)也有限，因此開(kāi)發(fā)一種經(jīng)濟(jì)、可靠、通量靈活且能夠覆蓋多位點(diǎn)的新甲基化檢測(cè)方法，是非常具有意義的。

研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的LAMP-MS方法創(chuàng)造性地將線性擴(kuò)增和飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合在一起，只需要1ng血漿cfDNA，通過(guò)多重PCR和單堿基引物延伸，能夠在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)數(shù)十個(gè)甲基化位點(diǎn)。該技術(shù)主要操作步驟如圖1所示：

LAMP-MS的完整工作流程

從血漿中提取1ng的cfDNA樣本，經(jīng)過(guò)末端修復(fù)后，用含有甲基化雙鏈T7啟動(dòng)子的DNA接頭進(jìn)行連接；

進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理后，非甲基化的胞嘧啶（dC）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（dU），而甲基化的胞嘧啶（5mC）保持不變；
使用T7 RNA聚合酶進(jìn)行無(wú)偏好性線性擴(kuò)增，產(chǎn)生μg數(shù)量級(jí)的RNA產(chǎn)物；
逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生微克水平的cDNA；
通過(guò)序列特異性PCR對(duì)含有特定DNA甲基化位點(diǎn)的DNA片段進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增；
對(duì)特定的DNA片段進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建和淺測(cè)序（1~2G深度），稱(chēng)為靶向LAMP-Seq，以確定5mC的化學(xué)計(jì)量；
利用位點(diǎn)特異性引物進(jìn)行單堿基延伸，如果延伸位點(diǎn)配對(duì)的是ddATP，代表此處為未甲基化的C，如果是ddGTP則代表甲基化的5mC，通過(guò)相應(yīng)的質(zhì)譜峰計(jì)算 5mC/C 比值。

為驗(yàn)證LAMP-MS方法的性能，研究團(tuán)隊(duì)合成了含有0%、5%、10%、25%、50%、75%及100% 5mC的一系列DNA探針混合物，利用1ng的上述探針混合物對(duì)LAMP-MS方法進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明，LAMP-MS能夠準(zhǔn)確地定量測(cè)量從0%到100%的5mC（圖2A），圖2B中標(biāo)曲表明檢測(cè)準(zhǔn)確性和理論值高度吻合。此外，文章表示，LAMP-MS在1ng探針混合物體系下的檢測(cè)限為5%的5mC的甲基化率（圖2B）。

圖2A 使用1ng 5mC探針驗(yàn)證LAMP-MS方法的靈敏度和準(zhǔn)確性

圖2B 使用1ng 5mC探針驗(yàn)證LAMP-MS方法的靈敏度和準(zhǔn)確性

在臨床上，來(lái)自癌癥患者血漿cfDNA樣本的生物標(biāo)志物豐度因人而異，因此研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用真實(shí)樣本對(duì)LAMP-MS方法進(jìn)行了驗(yàn)證。從10名結(jié)直腸癌患者和10名非結(jié)直腸癌患者中各獲取1ng的cfDNA樣本，檢測(cè)了結(jié)直腸癌篩查中有代表性的標(biāo)志物——SEPTIN9基因的4個(gè)甲基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)LAMP-MS能夠準(zhǔn)確測(cè)定四個(gè) SEPTIN9 位點(diǎn)的 5mC 甲基化率，且結(jié)直腸癌組和非結(jié)直腸癌組之間存在顯著差異，與高通量測(cè)序結(jié)果有很好的一致性（圖3）。

圖3 在結(jié)直腸癌和非結(jié)直腸癌患者中驗(yàn)證LAMP-MS方法

研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，同樣的策略也可以拓展到RNA的定量檢測(cè)中，例如在大多數(shù)高等生物mRNA中含量豐富、并且對(duì)于生命過(guò)程起著重要調(diào)節(jié)作用的m6A修飾的檢測(cè)。

研究團(tuán)隊(duì)將已發(fā)表的GLORI技術(shù)和核酸質(zhì)譜有機(jī)整合成為m6A Mass Array方法。該方法從HELA細(xì)胞中提取mRNA，將未甲基化的腺嘌呤轉(zhuǎn)化為肌苷，甲基化的m6A則保留下來(lái)。經(jīng)過(guò)末端修復(fù)、加接頭，再將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為模板進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，然后在m6A位點(diǎn)進(jìn)行單堿基延伸，若延伸ddATP則對(duì)應(yīng)檢測(cè)位點(diǎn)為m6A，ddGTP對(duì)應(yīng)未甲基化的腺嘌呤。從而能夠計(jì)算出該位點(diǎn)的 m6A/A 比率。

對(duì)比HELA細(xì)胞mRNA中RXRA基因（100% m6A），TNFRSF10B基因（100% m6A）和FBXL19基因（53% m6A），及其各自鄰近的非甲基化腺嘌呤位點(diǎn)，證明該m6A核酸質(zhì)譜方法能夠進(jìn)行有效的RNA甲基化定量檢測(cè)（圖4）。

圖4 m6A核酸質(zhì)譜方法：流程及驗(yàn)證

綜上所述，LAMP-MS（及m6A MASS ARRAY方法）基于核酸質(zhì)譜技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)超低量樣本的甲基化檢測(cè)，且結(jié)果可以直接可視化，不需要高通量測(cè)序繁復(fù)的數(shù)據(jù)分析處理過(guò)程；該技術(shù)利用核酸質(zhì)譜前處理體系，在單反應(yīng)中可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)多個(gè)5mC位點(diǎn)的檢測(cè)，且具有良好的特異性，在臨床上可用于同時(shí)篩查多種癌癥類(lèi)型的標(biāo)志物；并且，質(zhì)譜檢測(cè)也具有靈敏度和精密度的特點(diǎn)，能夠在極低樣本量下提供高度可靠的分析結(jié)果，是低豐度變異標(biāo)志物檢測(cè)的理想平臺(tái)；最后，核酸質(zhì)譜通量靈活，無(wú)需湊樣，能夠從容應(yīng)對(duì)大樣本量的臨床驗(yàn)證工作或小樣本量的研究工作。

因此，LAMP-MS技術(shù)有潛力作為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域重要的實(shí)用工具，為科研工作者的實(shí)驗(yàn)室研究和臨床樣本檢測(cè)提供了經(jīng)濟(jì)且先進(jìn)的應(yīng)用方案。

聚致生物核酸質(zhì)譜平臺(tái)

GeneTOF系列核酸質(zhì)譜分析系統(tǒng)是準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、高效的多重自動(dòng)化基因檢測(cè)平臺(tái)，能夠在單反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)1~50個(gè)基因位點(diǎn)變異靶標(biāo)的精確檢測(cè)，變異類(lèi)型包括SNP突變、甲基化、拷貝數(shù)變異、基因融合、堿基插入/缺失等。在腫瘤防治、出生缺陷防控、藥物基因組、病原體檢測(cè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

聚致生物

杭州聚致生物科技有限公司（簡(jiǎn)稱(chēng)“聚致生物"）創(chuàng)立于2021年，總部位于浙江杭州，是國(guó)內(nèi)儀器裝備企業(yè)——聚光科技生命科學(xué)旗下子公司，專(zhuān)注于生物質(zhì)譜類(lèi)及相關(guān)儀器產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)和推廣，致力于以先進(jìn)分析技術(shù)推動(dòng)生命科學(xué)研究和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，共建良好的產(chǎn)業(yè)生態(tài)。

聚致生物定位于上游儀器平臺(tái)供應(yīng)商，以開(kāi)放的態(tài)度同生命科學(xué)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)機(jī)構(gòu)合作，共同培育終端應(yīng)用市場(chǎng)，造福人類(lèi)的美好生活。

聚致生物產(chǎn)品

GeneTOF系列核酸質(zhì)譜分析系統(tǒng)

MEC-1000 核酸片段分析儀

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