優(yōu)化高電場(chǎng)強(qiáng)度電泳的實(shí)驗(yàn)條件需要綜合考慮多個(gè)因素，以下是一些建議：
選擇合適的凝膠
凝膠類型：根據(jù)核酸或蛋白質(zhì)的特性選擇合適的凝膠類型。例如，瓊脂糖凝膠適用于分離較大的核酸分子，而聚丙烯酰胺凝膠則更適合分離較小的核酸片段或蛋白質(zhì)，其分辨率更高。
凝膠濃度：凝膠濃度影響分子的遷移速度和分離效果。對(duì)于核酸電泳，分離大片段 DNA 時(shí)可選用低濃度瓊脂糖凝膠（如 0.8% - 1.0%），而分離小片段 DNA 或 RNA 時(shí)則需要較高濃度的凝膠（如 1.5% - 3.0%）。對(duì)于蛋白質(zhì)電泳，常用的聚丙烯酰胺凝膠濃度在 7.5% - 15% 之間，具體濃度取決于蛋白質(zhì)的分子量大小。
優(yōu)化緩沖液
緩沖液種類：不同的緩沖液具有不同的 pH 值和離子強(qiáng)度，會(huì)影響生物大分子的電荷狀態(tài)和遷移速度。例如，Tris - HCl 緩沖液常用于蛋白質(zhì)電泳，而 TBE 或 TAE 緩沖液則廣泛應(yīng)用于核酸電泳。TBE 緩沖液的緩沖能力較強(qiáng)，能更好地維持 pH 穩(wěn)定，但成本相對(duì)較高；TAE 緩沖液的導(dǎo)電性較好，適用于快速電泳，但緩沖能力稍弱。
離子強(qiáng)度：緩沖液的離子強(qiáng)度要適中。離子強(qiáng)度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致電流過(guò)大，產(chǎn)生過(guò)多熱量，甚至引起凝膠熔化；離子強(qiáng)度過(guò)低則會(huì)使電泳速度變慢，分離效果不佳。一般來(lái)說(shuō)，核酸電泳中 TBE 或 TAE 緩沖液的工作濃度在 0.5× - 1× 之間，蛋白質(zhì)電泳中常用的 Tris - HCl 緩沖液離子強(qiáng)度在 25 - 50 mmol/L 之間。
調(diào)整電場(chǎng)強(qiáng)度
確定最佳電壓范圍：在高電場(chǎng)強(qiáng)度電泳中，雖然較高的電壓可以縮短電泳時(shí)間，但過(guò)高的電壓會(huì)產(chǎn)生大量熱量，導(dǎo)致樣品擴(kuò)散、凝膠變形等問(wèn)題。因此，需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳的電壓范圍。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于核酸電泳，電場(chǎng)強(qiáng)度可在 10 - 20 V/cm 之間進(jìn)行嘗試；對(duì)于蛋白質(zhì)電泳，電場(chǎng)強(qiáng)度通常在 15 - 30 V/cm 之間。
采用恒壓或恒流模式：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的電泳模式。恒壓模式下，電壓保持恒定，隨著電泳的進(jìn)行，電流會(huì)逐漸減小，適用于分離不同大小的生物大分子混合物；恒流模式下，電流保持不變，電壓會(huì)隨著電阻的變化而變化，適用于對(duì)電泳時(shí)間要求較為嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)。
優(yōu)化樣品處理
樣品濃度：樣品濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致條帶拖尾或重疊，影響分離效果；樣品濃度過(guò)低則可能使條帶過(guò)于微弱，難以檢測(cè)。一般來(lái)說(shuō)，核酸樣品的濃度在 50 - 500 ng/μL 之間較為合適，蛋白質(zhì)樣品的濃度在 0.5 - 5 mg/mL 之間。
樣品緩沖液：在樣品中加入適量的樣品緩沖液，其作用是增加樣品的密度，使樣品能夠沉入加樣孔底部，同時(shí)還能提供一定的緩沖能力和顏色指示。樣品緩沖液中通常含有甘油、蔗糖等密度試劑，以及溴酚藍(lán)、二甲苯青等指示劑。
控制電泳溫度
使用冷卻裝置：如前文所述，高電場(chǎng)強(qiáng)度電泳會(huì)產(chǎn)生大量熱量，因此需要使用帶有冷卻裝置的電泳槽，通過(guò)循環(huán)冷卻水或內(nèi)置制冷系統(tǒng)控制電泳槽內(nèi)的溫度。一般將溫度設(shè)定在 15 - 25℃，以減少熱效應(yīng)的影響。
避免長(zhǎng)時(shí)間電泳：在保證分離效果的前提下，盡量縮短電泳時(shí)間，減少熱量的積累?？赏ㄟ^(guò)優(yōu)化其他實(shí)驗(yàn)條件，如提高凝膠濃度、調(diào)整緩沖液離子強(qiáng)度等，來(lái)加快生物大分子的遷移速度，從而縮短電泳時(shí)間。
選擇合適的電泳時(shí)間
預(yù)實(shí)驗(yàn)確定時(shí)間：不同的生物大分子在不同的凝膠和電場(chǎng)條件下，所需的電泳時(shí)間不同。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察樣品在凝膠中的遷移情況，確定最佳的電泳時(shí)間。一般來(lái)說(shuō)，核酸電泳時(shí)間在 30 分鐘至數(shù)小時(shí)不等，蛋白質(zhì)電泳時(shí)間在 1 - 3 小時(shí)左右。
實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：在電泳過(guò)程中，可以通過(guò)觀察指示劑的遷移位置來(lái)判斷電泳的進(jìn)度。當(dāng)指示劑遷移到合適的位置時(shí)，即可停止電泳。例如，在核酸電泳中，溴酚藍(lán)通常遷移到凝膠的 2/3 處或接近底部時(shí)，電泳結(jié)束；在蛋白質(zhì)電泳中，二甲苯青遷移到凝膠底部附近時(shí)，可停止電泳。
中級(jí)會(huì)員·2年
