半胱氨酸（cysteine, Cys）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/96S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

蛋白質(zhì)含有三種含硫氨基酸：甲硫氨酸、胱氨酸和Cys。其中，Cys 是唯yi一種含有巰基的含硫氨基酸，從甲硫氨酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，并且可與胱氨酸互相轉(zhuǎn)化。Cys 參與蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，經(jīng)常是蛋白質(zhì)活性中心的組成部分，還可以為其它生理生化反應(yīng)提供巰基。此外，Cys 大量積聚在皮膚和粘膜表面，在角蛋白生成中維持重要的巰基酶的活性，并且補(bǔ)充巰基，以維持皮膚的正常代謝，調(diào)節(jié)表皮最下層的色素細(xì)胞生成的底層黑色素。具有美白、解毒、改善炎癥和過(guò)敏性皮膚等作用。

測(cè)定原理：

Cys 還原磷鎢酸生成鎢藍(lán)，在 600nm 處有吸收峰；通過(guò) 600nm 吸光度，計(jì)算Cys 含量。

組成：

試劑三用前 1 天，向試劑三中加 2.5ml 蒸餾水充分溶解，再加 85％磷酸 0.625ml，混勻后蓋緊（防止水分散失）沸水浴 2h；冷卻后加 10ml 蒸餾水，4℃可保存 2 周。

標(biāo)準(zhǔn)品臨用前加 10 ml 蒸餾水，充分溶解。1μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)液，4℃避光保存。用不完的試劑 4℃可保存 3 天。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、85％磷酸和蒸餾水。

半胱氨酸提?。?/span>

1.  液體樣品中半胱氨酸提?。喝?0.1ml 液體樣品，加試劑一 0.9ml，充分混勻，8000g

4℃離心 10min，取上清液，待測(cè)。

2.  組織中半胱氨酸提?。喊凑战M織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4℃離心 10 min，取上清液待測(cè)。

3.     細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1.   分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 600 nm，蒸餾水調(diào)零。

2.   空白管：取微量石英比色皿/96 孔板，加入 20μl 蒸餾水，100μl 試劑二，100μl 試劑三，混勻后室溫靜置 15 min，于 600nm 處測(cè)定吸光值，記為 A 空白管。

3.   標(biāo)準(zhǔn)管：取微量石英比色皿/96 孔板，加入 20μl 標(biāo)準(zhǔn)液，100μl 試劑二，100μl 試劑三，混勻后室溫靜置 15 min，于 600nm 處測(cè)定吸光值，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。

4.   測(cè)定管：取微量石英比色皿/96 孔板，加入 20μl 上清液，100μl 試劑二，100μl 試劑三，混勻后室溫靜置 15 min，于 600nm 處測(cè)定吸光值，記為 A 測(cè)定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要做一次。

計(jì)算公式：

a.  使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1.   按液體樣品的體積計(jì)算：

半胱氨酸含量（μmol/ml）=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×（V樣總÷V 樣）=1×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)

2.   按樣本質(zhì)量計(jì)算：

半胱氨酸含量（μmol/g 鮮重）=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×

（V 樣總÷V 樣）÷W=1×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管) ÷W

3.   按照蛋白濃度計(jì)算：

半胱氨酸含量（μmol /mg prot）= [C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]÷

（V 樣×Cpr）=1×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管) ÷Cpr

4.   按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)] ×

（V 樣總÷V 樣×細(xì)胞數(shù)量）=1×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，1 μmol/ml；V 標(biāo)準(zhǔn)品：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.02ml；V 樣：反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積，0.02 ml；V 樣總：樣品提取液，1ml；W：樣品質(zhì)量，g。

b.  使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1.   按液體樣品的體積計(jì)算：

半胱氨酸含量（μmol/ml）=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×（V樣總÷V 樣）=1×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)

2.   按質(zhì)量計(jì)算：

半胱氨酸含量（μmol/g 鮮重）=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]×

（V 樣總÷V 樣）÷W=1×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管) ÷W

3.   按照蛋白濃度計(jì)算：

半胱氨酸含量（μmol /mg prot）= [C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)]÷

（V 樣×Cpr）=1×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管) ÷Cpr

4.    按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)] ×

（V 樣總÷V 樣×細(xì)胞數(shù)量）=1×(A 測(cè)定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，1 μmol/ml；V 標(biāo)準(zhǔn)品：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.02ml；V 樣：反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積，0.02 ml；V 樣總：樣品提取液，1ml；W：樣品質(zhì)量，g。

注意事項(xiàng)：

最di檢出限為 100μmol/L。