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一 嚴(yán)格的質(zhì)量控制

高特異性設(shè)計

采用巢式PCR（支原體檢測）或探針法（立克次氏體），通過多輪引物擴(kuò)增或雜交探針避免非特異性結(jié)合。

針對保守基因區(qū)域設(shè)計引物（如支原體rRNA操縱子），確保僅靶標(biāo)序列被擴(kuò)增。

靈敏度優(yōu)化

檢出限達(dá)10ng（鮑曼不動桿菌），并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法和ROC曲線評估靈敏度與特異性[8]。

二 標(biāo)準(zhǔn)化操作流程

防污染措施

超凈工作臺配制反應(yīng)體系，使用核酸清除劑（如Minerva PCR Clean™）。

分區(qū)分裝試劑，更換槍頭/手套避免交叉污染。

樣本處理規(guī)范

DNA提取專用試劑盒（支原體），模板量控制（如cDNA≤10%體系）。

樣本低溫保存（液氮/Trizol），運輸需符合生物安全要求。

三 驗證與質(zhì)控

多重驗證指標(biāo)

實驗階段測試靈敏度/重復(fù)性（諾如病毒研發(fā)）；臨床試驗驗證實際性能。

內(nèi)參染料（如ROX）校正孔間誤差，電泳/熒光實時監(jiān)控擴(kuò)增。

質(zhì)控品設(shè)置

每批次包含陰/陽性質(zhì)控（傳染性支氣管炎病毒），驗證體系無污染且有效。

四 環(huán)境與設(shè)備

穩(wěn)定反應(yīng)條件

冰上配制反應(yīng)液提高特異性[2]，程序優(yōu)化變性/退火溫度。

PCR儀定期校準(zhǔn)（如Q9604型號確保溫控精度）。

嚴(yán)格保存條件

多數(shù)試劑盒-20℃保存，避免反復(fù)凍融。

總結(jié)

特殊領(lǐng)域通過靶標(biāo)設(shè)計優(yōu)化+操作標(biāo)準(zhǔn)化+多重驗證+環(huán)境控制四重保障提升可靠性。例如支原體巢式PCR可檢出11種屬，qRT-PCR技術(shù)實現(xiàn)病毒準(zhǔn)確定量。