噴霧干燥技術(shù)制備裸 siRNA 干粉吸入劑
自從 RNA 干擾（RNAi）在 20 多年前被發(fā)現(xiàn)以來，利用這種基因沉默機制來治療疾病引起了科學(xué)家的關(guān)注。小干擾 RNA(siRNA) 是一類雙鏈 RNA 分子，長度為 20-25 個堿基對，類似于 miRNA，并且在 RNAi 途徑內(nèi)操作。它干擾了表達(dá)與互補的核苷酸序列的特定基因的轉(zhuǎn)錄后降解的 mRNA，從而防止翻譯。因此它們可以被設(shè)計成沉默任何特定蛋白質(zhì)的表達(dá)，通過 RNA 干擾沉默基因治療各種呼吸系統(tǒng)疾病，這已在動物和臨床研究中得到了廣泛的研究。siRNA 是一種親水性、帶負(fù)電荷的大分子，不能穿透生物膜，需要一個遞送載體來促進(jìn)細(xì)胞攝取，以便 siRNA 在細(xì)胞中發(fā)揮其基因沉默作用。
在許多體內(nèi)研究中，siRNA 與遞送載體結(jié)合，并通過靜脈給藥，遞送載體可保護(hù) siRNA 免受核酸酶降解和血清蛋白結(jié)合。對于呼吸系統(tǒng)的局部效應(yīng)，吸入是一種有利的給藥途徑。在酶活性低的作用位點可以實現(xiàn)高藥物濃度，其非侵入性提高了患者的依從性并降低了總治療成本。肺部給藥帶來的另一個吸引點是，可能不需要專門的給藥載體，而且裸 siRNA 可獲得令人滿意的基因沉默效果，這一點已在一些研究中得到證實。但關(guān)于 siRNA 的研究中，使用液體氣溶膠的研究相對較多，干粉可吸入制劑研究較為有限，本篇文獻(xiàn)中科學(xué)家重點研究了將裸 siRNA 以及和不同分散載體如甘露醇和L-亮氨酸通過噴霧干燥進(jìn)行制劑來考察 siRNA 制備干粉可吸入制劑的可能性。
實驗材料和方法
表1 顯示采用超純水溶解制備甘露醇、L-亮氨酸、 HSDNA 和 siRNA 水溶液，所有溶液的總?cè)苜|(zhì)濃度均為 1.5% w/v。
儀器參數(shù)：
BUCHI Mini Spray Dryer B-290 & B-296 形成閉環(huán)模式
加熱溫度80℃，吸氣率為90%（干燥氣流約35m3/h），進(jìn)料速率 1.4ml/min,霧化氣體流量 742L/h。雙流體噴嘴，噴冒孔徑 1.5mm。料液進(jìn)行霧化干燥，得到的干燥粉末通過旋風(fēng)分離器收集到玻璃小瓶中，粉末樣品收集后室溫下保存在帶硅膠的干燥器中。將各粉體通過凝膠阻滯試驗、粒度檢測、SEM、XPS、PXRD 和 HPLC 等方式進(jìn)行物理化學(xué)表征。
▲ BUCHI 噴霧干燥儀 B-290 & 296
結(jié)果
表2 通過激光衍射測量粉末的粒度，2% siRNA 的體積直徑較大，范圍為 2.6-8.0um，可見隨著配方中 L-亮氨酸含量的增加，粉末的粒徑減小。
▲ BUCHI Mini Spray Dry B-290 & 296
圖1 采用凝膠阻滯試驗檢測噴霧干燥后 siRNA 的結(jié)構(gòu)完整性。所有三種粉體中的 siRNA 均保持完整，噴霧干燥后未觀察到降解。圖2 采用 HPLC 色譜檢測結(jié)果與凝膠阻滯測定結(jié)果一致，從噴霧干燥后造粒粉體中獲得的 siRNA 光譜和噴霧干燥前的相應(yīng)料液中獲得的光譜幾乎相同（峰重疊）。圖3 通過 SEM 觀察粉體形態(tài)，無亮氨酸粉末顯示相對光滑的表面球形，隨著亮氨酸的增加，顆粒表面變粗糙，球形變差。當(dāng)含有甘露醇和L-亮氨酸等質(zhì)量制劑時，顆粒坍縮，失去球形。
結(jié)論
在這項研究中，香港大學(xué)和悉尼大學(xué)的科學(xué)家使用噴霧干燥技術(shù)將 siRNA 的裸形式配制成可吸入的干粉。研究了 siRNA 與甘露醇和 L-亮氨酸共混合后進(jìn)行噴霧干燥造粒，過去沒有 siRNA 載量 ＞2% w/w 的吸入型 siRNA 粉劑（含遞送載體）的報道。同時 siRNA 經(jīng)噴霧干燥后，即使沒有通常用于絡(luò)合或封裝保護(hù)的 siRNA 的遞送載體，也能成功保持其完整性；siRNA 粉末呈結(jié)晶狀，殘余水分低，這是穩(wěn)定配方的關(guān)鍵特征，但含水量都在 5%以下，說明噴霧干燥具有良好的工藝可行性。最后摻入 L-亮氨酸富集在顆粒表面，顯著促進(jìn)了粉末的分散性，改善了 siRNA 粉末的霧化效果。并通過X射線光電子能譜檢測，結(jié)果表明，L-亮氨酸在顆粒表面富集，作為分散增強劑，能夠有效促進(jìn)粉末的分散。再檢測的不同 siRNA 配方中，含 50% w/w L-亮氨酸的 siRNA 表現(xiàn)出最佳的空氣動力學(xué)性能，其高發(fā)射分?jǐn)?shù)（EF）約為 80%，適度的細(xì)顆粒分?jǐn)?shù)（FPF）約為 45%，對于干粉吸入劑具有很好實際參考意義。更重要的是，通過凝膠阻滯試驗和 HPLC 評估，成功地保留了 siRNA 的完整性，確保了藥物的活性！
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文獻(xiàn)來源
Inhaled powder formulation of naked siRNA using spray drying technology with L-leucine as dispersion enhancer
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