在以往推文中，我們詳細介紹了 PCR 實驗的基礎(chǔ)與進階技巧，解答了許多實驗中常見的問題及解決方案。今天，我們將深入探索 qPCR 的兩位“隱形英雄"：熔解曲線和 Ct 值。它們看似“低調(diào)"，卻往往是分析實驗結(jié)果的關(guān)鍵因素。讓我們一同揭開它們的的神秘面紗，聊聊 qPCR 的那些事兒！
實時熒光定量 PCR (Quantitative Real-time PCR，qPCR) 可實時監(jiān)測 DNA 擴增過程中的熒光信號，以實現(xiàn)對起始模板的定量分析。通過在 PCR 反應(yīng)體系中引入熒光探針或染料，使得每個擴增循環(huán)中產(chǎn)生的熒光信號可以被實時檢測，從而反映出擴增產(chǎn)物的量[1]。
簡單來說，它就像 DNA 擴增界的“股-票走勢分析師"，實時告訴你擴增了多少，何時到達“拐點" (Ct 值)。
圖 1. qPCR 流程圖[1]。
SYBR Green 和 TaqMan 是實時熒光定量 PCR (qPCR) 中兩種常用的檢測探針，各自具有不同的優(yōu)缺點。以下是這兩種方法的對比：
• 擴增曲線 (Amplification Curve)：評估反應(yīng)效率的重要工具，確保實驗結(jié)果的科學性和可靠性。
• Ct 值 (Cycle Threshold)：反應(yīng)樣品中靶標 DNA 的初始量，Ct 值越小，說明樣品中靶標 DNA 的初始量越多。
• 熔解曲線 (Melting Curve)：驗證特異性的小助手，判斷是否有非特異擴增或引物二聚體。
擴增曲線 (Amplification curve) 是指隨 PCR 反應(yīng)進行，根據(jù)熒光信號強度隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的曲線。
圖 2. qPCR 擴增曲線示意圖。
正常的擴增曲線 (S 型) 包括四大“黃金階段"：基線期、指數(shù)增長期、線性增長期、平臺期。
• 基線期：“熱身階段"，通常出現(xiàn)在反應(yīng)的前 3 - 15 個循環(huán)內(nèi)。這一階段儀器會聰明地根據(jù)這段“無聲無息"的信號計算出基線范圍，為后續(xù)的“精彩瞬間"埋下伏筆。
• 指數(shù)增長期：PCR 反應(yīng)的“高潮時刻"，是擴增曲線快速上升的階段。所有試劑都“活躍"了，DNA 聚合酶就像賽車手，快速合成，反應(yīng)也達到了最佳效率——這就是“指數(shù)"的威力！這一階段是做定量分析的最佳時期，PCR 產(chǎn)物量和初始模板量質(zhì)檢幾乎可以畫出一條完-美的直線。
• 線性增長期：PCR 反應(yīng)進入“疲軟期"。隨著原料逐漸耗盡，DNA 聚合酶開始“累了"，反應(yīng)效率逐漸降低，熒光信號的增長速度慢慢放緩，產(chǎn)物量和初始模板量之間的指數(shù)關(guān)系開始變得不那么“準確"。
• 平臺期：PCR 反應(yīng)到達“終點站"，這一階段熒光信號基本停滯不前，趨于平穩(wěn)，擴增就此“畫上句號"。不同反應(yīng)進入平臺期的時間和信號高低不同，反應(yīng)的“完結(jié)"也各有差異。
擴增曲線分析:
你的擴增曲線是“黃金路線"還是“問題頻發(fā)"
Ct 值，全稱為 Cycle Threshold，即在 PCR 反應(yīng)中，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
簡單來說，Ct 值指在 PCR 反應(yīng)中的熒光信號突破了“背景噪音"，開始呈指數(shù)級上升時，對應(yīng)的那個“拐點"所處的循環(huán)次數(shù)，它告訴我們“什么時候開始有戲了"?？偨Y(jié)一句話，Ct 值就像是 PCR 實驗中的“開場白"，它告訴你“什么時候開始精彩"！
Ct 值和起始模板量之間的關(guān)系就像參加跑步比賽，起跑線距離終點的遠近決定了跨越終點的時間。簡單來說，起始模板量越多，PCR 反應(yīng)越快，Ct 值就越小；而起始模板量越少，反應(yīng)就會慢一些，Ct 值自然就會更大。
通過逐步提高溫度同時監(jiān)測每個溫度點的熒光信號變化，最終生成一條“熔解曲線" (Melting Curve)。隨著溫度上升，DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)開始解開，熒光信號從雙鏈中釋放出來，熒光信號下降，最終升高到 DNA 雙鏈解開 50% 的溫度即為溶解溫度 (Tm)，是 DNA 解鎖的關(guān)鍵溫度。
熔解曲線聽起來像是 DNA 在做一場高溫的“脫單"大典！它揭示了隨著溫度升高，DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)逐漸分開變成“單鏈情人"的過程，用于分析 PCR 產(chǎn)物的濃度、特點及純度。
圖 3. qPCR 熔解曲線示意圖。
熔解曲線分析:
你的熔解曲線是“好演員"還是“草臺班子"?
qPCR 實驗中，Ct 值幫你量化基因表達，熔解曲線幫你驗證特異性。強強聯(lián)合堪稱 qPCR 實驗成功的“黃金搭檔"。所以，下次當你看到漂亮的 Ct 值和干凈的熔解曲線時，不妨給自己點個贊！
關(guān)注我們，帶你玩轉(zhuǎn)分子生物學的每一個細節(jié)，實驗成功就是這么簡單！歡迎留言分享，讓我們一起成為 qPCR 實驗的高手。
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[1] Grace Adams. A beginner’s guide to RT-PCR, qPCR and RT-qPCR. Biochem (Lond) 22 June 2020; 42 (3): 48–53.
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