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基因與細(xì)胞治療領(lǐng)域的病毒載體生產(chǎn)用細(xì)胞株的開(kāi)發(fā)

時(shí)間：2022-5-26 閱讀：737
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基因治療被認(rèn)為是許多嚴(yán)重的和危及生命的疾病有效的治療手段，得到越來(lái)越多人的關(guān)注。同時(shí)，基因治療的適應(yīng)癥正從罕見(jiàn)/極罕見(jiàn)疾病向更常見(jiàn)疾病發(fā)生轉(zhuǎn)變，患者數(shù)量和綜合療法越來(lái)越多。因而，大規(guī)模的基因治療病毒載體生產(chǎn)是行業(yè)的迫切需求。

 


2020年，F(xiàn)DA更新了關(guān)于基因治療臨床試驗(yàn)申請(qǐng)(INDs)的化學(xué)、制造和控制指導(dǎo)原則，內(nèi)容包含穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株開(kāi)發(fā)及細(xì)胞克隆性確證等。文件指出，細(xì)胞庫(kù)（Cell bank）的穩(wěn)定性及純度是一個(gè)需要考慮的重要方面。非單克隆來(lái)源的細(xì)胞群中，其細(xì)胞異質(zhì)性相對(duì)較高，產(chǎn)量低的細(xì)胞系往往與高產(chǎn)細(xì)胞群體競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致高產(chǎn)細(xì)胞個(gè)體占比越來(lái)越少，最終隨著傳代次數(shù)的增加，導(dǎo)致細(xì)胞庫(kù)或工作庫(kù)的質(zhì)量下降，因此，通過(guò)單克隆細(xì)胞篩選是提高病毒載體產(chǎn)量及質(zhì)量的重要步驟。單克隆源性的確證是一種控制細(xì)胞種群降低其異質(zhì)性的方法，通過(guò)防止異種細(xì)胞群體的產(chǎn)生，來(lái)保障未來(lái)生產(chǎn)出的病毒產(chǎn)品的質(zhì)量不受影響。

CEVEC公司（CEVEC Pharmaceuticals）針對(duì) ELEVECTA® AAV包裝細(xì)胞系的研究數(shù)據(jù)顯示，通過(guò)單克隆篩選出的細(xì)胞株其AAV產(chǎn)量要比非單克隆細(xì)胞來(lái)源的高10倍左右。

張瑰宜博士在“生物藥生產(chǎn)用細(xì)胞株構(gòu)建和篩選策略”研討會(huì)上分享了她們使用Cytena 的單細(xì)胞打印機(jī)SCP的感受，其噴墨式打印技術(shù)溫和而高效的分選單細(xì)胞，簡(jiǎn)化篩選工作流程，大大提高了單克隆有效率，獲得了穩(wěn)定性高及一致性好的單克隆，用于后續(xù)的AAV生產(chǎn)，大大的提高了AAV產(chǎn)量。

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克隆HEK293細(xì)胞的記錄

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HEK293單克隆細(xì)胞提高AAV產(chǎn)量


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生物藥生產(chǎn)用細(xì)胞株構(gòu)建和篩選策略

 

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英國(guó)著名的葛蘭素史克（GlaxoSmithKline，GSK）藥物研究中心報(bào)告了一種如何快速獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)的293T細(xì)胞，生成慢病毒載體的方法：將編碼所有慢病毒載體成分的單個(gè) DNA 結(jié)構(gòu)體穩(wěn)轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，單細(xì)胞打印機(jī)進(jìn)行單克隆篩選，獲取遺傳學(xué)和功能穩(wěn)定的適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的生產(chǎn)用293細(xì)胞系。由此產(chǎn)生的懸浮細(xì)胞系可生產(chǎn)出與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染一樣高滴度的病毒，可以在一次性攪拌罐生物反應(yīng)器中輕松放大，并且在后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中遺傳和功能穩(wěn)定。此方法將降低慢病毒載體的大規(guī)模生產(chǎn)成本，提升慢病毒載體在細(xì)胞治療中的應(yīng)用價(jià)值。（Chen Y H , Pallant C , Sampson C J , et al. Rapid lentiviral vector producer cell line generation using a single DNA construct[J]. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2020.）

在基因編輯領(lǐng)域，Stephan Riesenberg等學(xué)者進(jìn)行細(xì)胞克隆基因型和靶基因拷貝數(shù)分析時(shí)使用 Cas9 核糖核蛋白和 DNA 供體電穿孔在 FRMD7 基因中編輯 409-B2 hiPSC，分別用（不用）2 M M3814 處理細(xì)胞 3 天后使用單細(xì)胞打印機(jī)(Cytena)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單克隆化用于后續(xù)分析。文章中HEK293 和 K562 細(xì)胞的單克隆化也是通過(guò)使用單細(xì)胞打印機(jī)分選單細(xì)胞來(lái)獲得的。（Stephan R ,  Manjusha C ,  Dominik M , et al. Simultaneous precise editing of multiple genes in human cells[J]. Nuclc Acids Research, 2019(19):19.）

Gross等采用f.sight™單細(xì)胞打印機(jī)，通過(guò)GFP報(bào)告基因，用于選擇和克隆CRISPR/Cas9編輯以敲除RANKL蛋白的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，以進(jìn)一步增強(qiáng)MSCs在再生醫(yī)學(xué)中的治療能力。
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參考資料

[1] 提升高產(chǎn)細(xì)胞株篩選效率，助力基因治療、抗體藥物等工藝開(kāi)發(fā)——單細(xì)胞打印機(jī)（附案例分享）

[2] 簡(jiǎn)化CRISPR基因編輯的干細(xì)胞的工作流程，提高單克隆效率

 

 

艾貝泰作為Cytena中國(guó)代理，公眾號(hào)（Applitech）中多個(gè)軟文詳細(xì)介紹Cytena單細(xì)胞打印機(jī)篩選原理、功能更新、應(yīng)用文獻(xiàn)以及案例分享等，掃碼關(guān)注公眾號(hào)，不間斷更新關(guān)于Cytena單細(xì)胞打印機(jī)以及其他代理品牌信息。

 

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