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凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)分為哪幾個(gè)過(guò)程
蛋白質(zhì)被認(rèn)為是構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分。食物中的蛋白質(zhì)是人體中氮的*來(lái)源，具有糖類和脂肪不可替代的作用。含氮量是蛋白質(zhì)區(qū)別于其他有機(jī)化合物的重要標(biāo)志。在檢驗(yàn)食品中蛋白質(zhì)時(shí)，通常是先檢定出食品中的總氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，以此得到蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定過(guò)程。
一.原理
向樣品中加入濃硫酸和催化劑，充分混勻，然后加熱消化分解，樣中碳和氫被氧化成二氧化碳和水，其中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。
二.樣品消化
濃硫酸具有脫水性和氧化性，可使有機(jī)物中的碳、氫被氧化為二氧化碳和水，蛋白質(zhì)會(huì)分解為氨，然后氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。通常加入硫酸鉀和硫酸銅作為催化劑來(lái)加快蛋白質(zhì)分解。硫酸鉀可以提高溶液的沸點(diǎn)，一般情況下，純硫酸的沸點(diǎn)在340 ℃左右，但是在添加硫酸鉀后，可提高至400 ℃以上。提高溫度使有機(jī)物加快分解。但是不能加入過(guò)多的硫酸鉀，否則會(huì)因?yàn)闇囟冗^(guò)高，使生成的硫酸銨發(fā)生熱分解成氨而造成損失。硫酸銅除作為催化劑外，還可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá)，有機(jī)物全部消化*后，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色，硫酸銅還可以做蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑。
三.蒸餾
消化液中的硫酸銨在堿性環(huán)境下會(huì)轉(zhuǎn)化成氨。為防止水中微量的氨氣受熱逸出，影響測(cè)定結(jié)果，所以水蒸氣發(fā)生器中的水要保持酸性。硫酸銨是一種強(qiáng)酸弱堿鹽，需要足夠的堿液使結(jié)合態(tài)的氨*反應(yīng)并釋放出來(lái)，這個(gè)過(guò)程中的氫氧化鈉一定要過(guò)量，過(guò)量的氫氧化鈉會(huì)與硫酸銅生成藍(lán)色的氫氧化銅沉淀，氫氧化銅受熱分解成黑色的氧化銅沉淀。檢驗(yàn)蒸餾是否完成，可用奈氏試紙法，NH4+或NH3遇奈氏試劑會(huì)反應(yīng)生成棕紅色的dian化汞銨化合物。
四.吸收
加熱蒸餾放出的氨可用硼酸溶液吸收，硼酸有吸收氨的作用，又因其呈微弱酸性，不影響下一步滴定時(shí)指示劑的變色反應(yīng)。溫度過(guò)高會(huì)使硼酸吸收液對(duì)氨的吸收作用減弱，從而造成損失，故一般不超過(guò)40 ℃。
五.滴定
待吸收*后，用硫酸或者鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行酸堿滴定，滴定液的濃度直接影響結(jié)果的性，必須按照要求進(jìn)行配制和標(biāo)定。混合指示劑在中性溶液中呈灰色，滴定終點(diǎn)時(shí)液體呈灰色。