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在清潔驗證程序開發(fā)過程中，關鍵目標是工藝驗證：通過分析數(shù)據(jù)證明該過程的每一步都能將產(chǎn)品和清潔劑殘留去除到預定的可接受水平。美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）1993 年的指南要求任何驗收標準都必須 “具有科學依據(jù)” 。這些標準會因所采用的清潔程序類型（例如在線清潔（CIP）或離線清潔（COP）），以及清潔程序是在同一產(chǎn)品的不同批次之間進行還是在更換產(chǎn)品類型時進行而有所不同。了解用戶所測試的分析物和清潔劑殘留的類型（例如蛋白質(zhì)發(fā)酵液樣品和陽離子表面活性劑）也很重要。這些參數(shù)決定了驗證程序的檢測方法。

TOC 分析正迅速成為清潔驗證的優(yōu)選分析方法，原因如下：許多制藥公司都在采用基于全產(chǎn)品方法開發(fā)清潔驗證方法，即確定是否存在任何殘留，而不考慮其來源（包括產(chǎn)品、清潔劑、化學品、溶劑、副產(chǎn)品、降解物和微生物污染物等）。這種方法與 TOC 分析配合良好，因為 TOC 分析能夠檢測分子結構中含碳的任何 API 或清潔劑殘留。詹金斯（Jenkins）等人發(fā)現(xiàn) TOC 分析在清潔驗證中的應用得到了有力支持：“TOC 檢測限低、分析時間短、與其他方法相比成本較低，并且能夠檢測所有含碳殘留物” 。通過對比 TOC 分析、高效液相色譜法（HPLC）、薄層色譜法、分光光度法（UV）、酶聯(lián)免疫吸附測定法、電泳法、pH 值檢測、電導率檢測和目視分析法，他們發(fā)現(xiàn) TOC 分析的性能與 HPLC 和分光光度法相當，甚至更優(yōu)。

越來越依賴 TOC 分析的其他原因還包括：

• 初始資金投入、運行和維護成本相對較低

• 操作簡便

• 靈敏度高

• 難降解分析物的回收率高

• 干擾小

在開發(fā)階段，使用一種或多種能夠代表實際清潔驗證過程中遇到的活性劑類型的模型化合物對分析技術進行測試，以此展示該技術的穩(wěn)健性、準確性和精密度。

牛血清白蛋白（BSA）是一種可以很好地模擬其他蛋白質(zhì)類、難氧化 API 的化合物。血清白蛋白是所有哺乳動物血漿中常見的一種蛋白質(zhì)，也是最為人熟知且經(jīng)過深入研究的蛋白質(zhì)之一。通過核磁共振（HNMR）和 X 射線晶體學分析，BSA 大致呈心形，含有 607 個氨基酸殘基，分子量約為 66317.25 原子質(zhì)量單位（amu） 。BSA 本身作為活性劑在制藥行業(yè)中應用廣泛，同時也是開發(fā)穩(wěn)健的清潔驗證分析方法的理想模型化合物。蛋白質(zhì)很難被氧化，當使用蛋白質(zhì)化合物作為測試劑開發(fā) TOC 檢測方法時，對于與其他活性劑和抗氧化性較弱的分析物相關的分析結果，人們可以給予高度信任。

實驗目的是使用 BSA 作為模型化合物，確定 TOC 分析儀的線性響應范圍，以便開發(fā)清潔驗證方法，應用賽萊默旗下品牌 OI Analytical Aurora 1030W TOC 分析儀和 1088 自動進樣器（圖 1）。

實驗使用的校準曲線（圖 2）展示了 Aurora 1030W TOC 分析儀在較寬的碳濃度范圍內(nèi)進行高精度校準的能力。該儀器使用 KHP 進行校準，KHP 是一種廣泛使用且易于氧化的標準物質(zhì)。圖 2 中的校準曲線由 PC 軟件生成，該軟件與 Aurora 1030W 配備的觸摸屏軟件相同。響應因子表示儀器以每 1000 個面積計數(shù)中 μg C 為單位的響應值。

圖 2：Aurora 1030W TOC分析儀的KHP校準曲線

以確定 1030W TOC 分析儀對 BSA 的線性響應范圍為目標。這一概念與儀器校準類似，能夠揭示儀器對 BSA 濃度呈線性響應的工作范圍。測試結果在圖 3 中以每個樣品的 BSA 濃度與 TOC 分析儀的面積計數(shù)響應值的關系圖呈現(xiàn)。數(shù)據(jù)顯示，Aurora 1030W 能夠分析濃度約為 0.5 - 20ppm 的 BSA。

圖3：BSA 濃度與 TOC 面積計數(shù)關系圖

作為一種難氧化的蛋白質(zhì)，BSA 在其他研究中顯示出回收率低和儀器響應不佳的問題。但這些數(shù)據(jù)表明，加熱過硫酸鹽氧化技術能夠在較寬的工作范圍內(nèi)徹底消解 BSA 樣品中的碳，并實現(xiàn)完全回收。如果繪制的圖采用二階最佳擬合曲線，則表明儀器對 BSA 的回收不完全。在這些情況下，數(shù)據(jù)通常代表分析儀消解 BSA 的穩(wěn)健性上限；隨著樣品濃度的增加，儀器響應相對保持不變。

下表進一步展示了 Aurora 1030W 在分析 BSA 等蛋白質(zhì)樣品時可達到的精密度和準確度。在分析時，制備了已知濃度的 BSA 樣品。由此可以計算出理論碳濃度，并與測量得到的碳濃度進行比較。根據(jù) BSA 的分子量 66317.25amu 和碳的質(zhì)量百分比 53.065%，可以通過以下公式將碳濃度與 BSA 濃度關聯(lián)起來：

數(shù)據(jù)顯示，加熱過硫酸鹽技術能夠以高精度（平均相對標準偏差為 2.5%）和高準確度（平均回收率為 87%）分析 BSA 樣品。

在清潔驗證中，確定碳的適當回收率至關重要。為了準確評估系統(tǒng)回收率，必須確定理論濃度與實際濃度的斜率。在圖 4 中，繪制了表 2 中測定的 BSA 回收率，并得出了斜率。

圖4：BSA碳回收

由于 BSA 中理論碳含量預期為 53.065%，我們可以根據(jù)以下公式計算實際碳含量：
理論濃度/直線斜率=實際濃度
對于 BSA，53.065/1.1317=46.8896%碳。

通過了解分析儀的回收率，就可以為未來測定未知樣品中 BSA 含量的實驗確定合適的范圍。