THMG培養(yǎng)基是一種常用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基，尤其適用于體細胞胚胎發(fā)生、愈傷組織誘導及單細胞培養(yǎng)等研究。其名稱來源于核心成分：T(Timing Adjustment Compound)、H(Hyponex)、M(Maltose)、G(Gellan Gum)，并輔以植物激素和有機添加劑。以下是詳細的配置流程及原理說明：
一、THMG培養(yǎng)基的核心成分與功能
1. T(Timing Adjustment Compound)
- 通常指噻苯隆(Thidiazuron, TDZ)，是一種苯基脲類植物生長調(diào)節(jié)劑。
- 作用：促進胚胎發(fā)生初期細胞分裂，抑制分化，維持分生組織活性。
- 濃度：0.1-0.5 μM(需根據(jù)植物材料調(diào)整)。
2. H(Hyponex)
- 一種含氮磷鉀的復合肥(N:P:K=10:10:10)，提供基礎(chǔ)營養(yǎng)。
- 作用：補充大量元素，支持細胞基礎(chǔ)代謝。
- 濃度：通常為1-2 g/L。
3. M(Maltose)
- 麥芽糖作為碳源，相較于蔗糖更易被某些植物細胞吸收。
- 作用：提供能量，促進滲透壓平衡。
- 濃度：30-60 g/L(根據(jù)滲透壓需求調(diào)整)。
4. G(Gellan Gum)
- 凝膠蘭作為凝固劑，替代傳統(tǒng)的瓊脂，避免雜質(zhì)干擾。
- 濃度：2.5-3.0 g/L(高壓滅菌后形成固態(tài)培養(yǎng)基)。
二、輔助成分與添加劑
1. 微量元素與維生素
- MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分：包括NH?NO?、KNO?、CaCl?·2H?O、MgSO?·7H?O等，提供礦質(zhì)營養(yǎng)。
- 維生素：如肌醇(100 mg/L)、煙酸(0.5 mg/L)、吡哆醇(0.5 mg/L)等，促進代謝活動。
2. 有機氮源
- 谷氨酰胺(Glutamine)或天冬酰胺(Asparagine)：補充氮源，促進蛋白質(zhì)合成。
- 濃度：通常為100-200 mg/L。
3. 植物激素
- 2,4-D(0.1-1 mg/L)：誘導愈傷組織形成。
- 6-BA(0.5-2 mg/L)：促進細胞分裂和胚性維持。
- NAA(0.1-0.5 mg/L)：調(diào)控根分化(按需添加)。
4. 抗氧化劑
- 抗壞血酸(VC)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)：清除酚類物質(zhì)，防止褐變。
- 濃度：1-5 g/L(根據(jù)材料酚含量調(diào)整)。
三、配置步驟與注意事項
1. 母液配制
- 大量元素母液(10×)：稱取MS配方中的鹽類，溶解后定容至1 L，4℃保存。
- 微量元素母液(100×)：按MS配方稱取Fe鹽、Mn、Zn等，螯合后保存。
- 有機添加劑母液：單獨配制維生素、激素(如2,4-D、6-BA)、谷氨酰胺等，過濾滅菌。
- THMG核心母液：Hyponex、麥芽糖、凝膠蘭可混合配制，噻苯隆需單獨溶解(先用少量乙醇助溶)。
2. 培養(yǎng)基配制流程
- 步驟1：量取800 mL蒸餾水，加入Hyponex和麥芽糖，攪拌至溶解。
- 步驟2：加入凝膠蘭，煮沸后定容至1 L。
- 步驟3：調(diào)pH至5.8-6.0(用1 M NaOH或HCl調(diào)節(jié))。
- 步驟4：分裝至培養(yǎng)瓶，每瓶約50-100 mL。
- 步驟5：121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻后加入過濾滅菌的激素母液。
3. 關(guān)鍵注意事項
- 激素時效性：2,4-D和6-BA需在滅菌后添加，避免高溫分解。
- 滲透壓控制：麥芽糖濃度需根據(jù)材料調(diào)整(如高滲環(huán)境抑制褐變)。
- 防污染：所有操作需在超凈臺完成，母液儲存不超過1個月。
四、應(yīng)用與優(yōu)化建議
1. 適用材料
- 適用于十字花科、豆科等體胚誘導困難的植物，如擬南芥、大豆、油菜等。
- 對單細胞懸浮培養(yǎng)效果明顯，需配合搖床振蕩培養(yǎng)。
2. 常見問題與優(yōu)化
- 褐變問題：增加抗壞血酸或PVP濃度，或提高麥芽糖比例。
- 胚性喪失：降低2,4-D濃度，補充ABA(0.1-1 μM)促進成熟。
- 玻璃化現(xiàn)象：減少凝膠蘭用量，或添加聚乙烯醇(PVA)改善固化狀態(tài)。
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