Lumafluor Green RetroBeads

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原始、可靠的熒光示蹤劑

luma fluor/Green retro beads IX(100 l)luma fluor是Lumafuor公司的第一個反向示蹤產(chǎn)品，也是一個被證明有效的產(chǎn)品(該產(chǎn)品的有效性已被數(shù)百篇從無脊椎動物到哺乳動物實驗的研究論文所證實)。

該示蹤劑產(chǎn)品在體內(nèi)注射時濃度高，不易擴(kuò)散，信號強(qiáng)，對活細(xì)胞或活體無毒，存活時間在一年以上。它與以下大多數(shù)示蹤劑、原位雜交檢測技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)兼容。

Further details are presented in: Katz, L.C., Burkhalter, A., and Dreyer, W.D. Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex. Nature 310: 498-500 (1984), and Katz, L.C. and Iarovici, D.M. Green fluorescent latex microspheres: a new retrograde tracer. Neuroscience 34: 511-520 (1990).

熒光乳膠微球的使用方案 

如何供應(yīng):封閉的小瓶含有懸浮在蒸餾水中的珠子的濃縮溶液。如果紅色珠子用于神經(jīng)元路徑的逆行追蹤，溶液可以原樣使用，或者稀釋。在大鼠視覺皮層中，當(dāng)使用紅色珠子時，1:4的稀釋度似乎不會降低逆行標(biāo)記的質(zhì)量或程度。然而，對于初始實驗，我們強(qiáng)烈建議使用全強(qiáng)度的溶液。除蒸餾水外，標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液(NaCl，KCl)也可用作稀釋劑。所提供的綠珠*全為逆行追蹤實驗做好了準(zhǔn)備。不建議稀釋綠珠。

存儲:珠溶液應(yīng)儲存在冰箱中的加濕容器中，以防止蒸發(fā)。不要凍結(jié)！被冰凍的珠子將不起作用，并且不能被解救。如果珠子變干，它們就不能被重組。這種材料沒有規(guī)定保存期限，但是，如果儲存得當(dāng)，可以保存幾年。

應(yīng)用:最好使用壓力注射珠子(例如，1 ml Hamilton注射器，或加壓空氣注射系統(tǒng))。對于局部回路工作，已經(jīng)通過具有30-50 μm直徑吸頭的玻璃移液管注入了非常小的體積(30-50 nl)。對于常規(guī)逆行追蹤，使用更大體積(0.1-0.3 ul)和更大直徑的移液器吸頭。然而，即使注射量很大，珠子也不會從注射部位擴(kuò)散很遠(yuǎn)(通常小于1 mm)。因此，為了標(biāo)記投射到大結(jié)構(gòu)的所有或大部分神經(jīng)元，應(yīng)該進(jìn)行幾次注射。不推薦將珠的離子電滲應(yīng)用作為遞送示蹤劑的有效手段。然而，珠子確實有一個凈負(fù)電荷。

生存時間:在大多數(shù)溫血脊椎動物系統(tǒng)中，注射后的最短有效存活時間約為24小時。標(biāo)記強(qiáng)度隨著存活時間的延長而增加，最長可達(dá)48小時。48小時后，沒有觀察到標(biāo)記強(qiáng)度的增加(或減少)。這些值在冷血動物中可能有相當(dāng)大的不同，建議初始存活時間為一周。最大存活時間尚未確定，但即使在14個月的存活時間后，標(biāo)簽在質(zhì)量或程度上也沒有變化。細(xì)胞可能會被*久標(biāo)記。未觀察到對動物或神經(jīng)元的毒性作用。

定影和處理:標(biāo)準(zhǔn)固定是用0.1 M磷酸鹽緩沖液洗滌，然后用0.1 M磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中的4%多聚甲醛洗滌。戊二醛會產(chǎn)生大量的組織自體熒光，這可能會模糊珠標(biāo)記的神經(jīng)元，如果可能，應(yīng)避免使用。綠珠在戊二醛固定材料中全看不見。冷凍切片收集在磷酸鹽緩沖液中，固定在明膠包被的載玻片上，風(fēng)干。*全干燥后，載玻片可在二甲苯中清洗1分鐘，蓋上涂有Fluoromount或Krystalon的蓋子。Fluoromount可從Atomergic Chemetals Corp .，F(xiàn)armingdale，NY獲得；Krystalon來自新澤西州吉布森鎮(zhèn)的Harleco (EM Industries)。

短暫接觸酒精和二甲苯不會造成傷害，但長時間接觸(超過5分鐘)會破壞珠子。珠子對甘油非常敏感，如果放在含甘油的溶液中會迅速褪色。在需要非*久性清潔/固定劑的情況下，水楊酸甲酯優(yōu)于甘油。如果載玻片保存在暗處，細(xì)胞中的標(biāo)記至少在一年內(nèi)不會褪色(盡管背景自發(fā)熒光可能會顯著增加)。迄今為止，在塑料包埋后保留珠標(biāo)記的嘗試尚未成功。

觀察:紅色珠子中的染料是羅丹明，因此可以使用任何為羅丹明設(shè)置的熒光濾光片。一些較舊的尼康羅丹明濾鏡組給出了非常高的背景，這可以使標(biāo)記的細(xì)胞不可見。Zeiss和Leitz標(biāo)準(zhǔn)羅丹明濾光片均獲得了良好的效果。對于綠珠，寬帶熒光素濾光器效果很好。黃色濾鏡組給出了更強(qiáng)烈的信號，但代價是更高的背景。窄帶熒光素濾光器將給出比寬帶濾光器弱得多的信號。

即使經(jīng)過長時間的觀察或顯微攝影，珠子也不會明顯褪色。

對于低倍率、低數(shù)值孔徑的干燥物鏡(如X4、X10)，標(biāo)簽通常不可見。如果細(xì)胞被強(qiáng)烈標(biāo)記，X10浸沒物鏡(數(shù)值孔徑為0.4或更大)或更高功率的干物鏡通常會顯示細(xì)胞。然而，X25浸沒物鏡通常會非常清晰地顯示出低倍率物鏡所遺漏的標(biāo)記細(xì)胞。這些警告對于綠珠來說尤其如此。在決定實驗無效之前，用浸沒物鏡檢查注射部位附近的切片。應(yīng)該存在大量局部標(biāo)記的細(xì)胞。

綠珠用戶的附加信息:在迄今為止所做的工作中，年輕的動物似乎比年老的動物更好地傳遞標(biāo)簽。此外，年輕動物的組織自體熒光較低。因此，在涉及綠珠的實驗中，如果可能的話，最好使用較年輕的動物。

因為綠珠在比紅珠更短的波長下被激發(fā)，組織自體熒光是一個更大的問題。因此，將自發(fā)熒光最小化的努力將產(chǎn)生更好的對比信號。減少自體熒光的方法包括:1)使用更薄的切片(例如30 um而不是40或50 μm)；2)使用更年輕的動物，以及3)在蓋玻片后立即檢查切片(背景隨著時間推移而增加)。

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