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【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：豬輪狀病毒 A 組（PRV-A）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name：Porcine Rotavirus Group A Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測豬臨床樣品（豬小腸和新鮮糞便）或細(xì)胞培養(yǎng)物中豬輪狀病毒 A 組的 RNA，適用于豬輪狀病毒 A 組感染的輔助檢測。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計一對豬輪狀病毒 A 組特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對豬輪狀病毒 A 組的 RNA 進(jìn)行體外擴增檢測，用于科研實驗中對可疑感染者的病原學(xué)檢測。

【試劑組成】

包裝規(guī)格50T/盒

PRV-A 反應(yīng)液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

PRV-A 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

采集腹瀉急性期的小腸（5.0cm~10.0cm）或新鮮糞便（5.0g~10.0g），放到密封袋中，置于帶有冰袋的保   存箱中，送至實驗室[1]。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

小腸樣品：取 5.0cm~10.0cm 小腸組織，用剪刀剪碎，加入 10mL PBS，用適宜規(guī)格的組織研磨器或研缽研磨后轉(zhuǎn)移到適宜玻璃瓶中，每毫升樣品加入 RNA 酶抑制劑 RRI（40U/μL）500μL，-20℃反復(fù)凍融 3 次后，搖勻，取 1.0mL 到 1.5mL 離心管中，經(jīng) 12000 r/min 離心 5min，取 500μL 上清備用。

糞便樣品：取 0.5g~1.0g 新鮮糞便，加入到含 5.0mL~10.0mL 樣品處理液（配方參考 GB/T 34756-2017 豬輪狀病毒病病毒 RT-PCR 檢測方法的規(guī)范性附錄 A.2）的玻璃瓶中，每毫升樣品加入 RNA 酶抑制劑 RRI（40 U/μL）500μL，-20℃反復(fù)凍融 3 次后，搖勻，取 1.0mL 到 1.5 mL 離心管中，經(jīng) 12000 r/min 離心 5min，取500μL 上清液備用。

細(xì)胞培養(yǎng)物樣本：取細(xì)胞培養(yǎng)物，每毫升樣品加入 RNA 酶抑制劑 RRI（40 U/μL）500μL，反復(fù)凍融 3 次， 經(jīng) 2000 r/min 離心 10min，取 1mL 上清備用[ 1]。

1.2核酸提取

推薦采用公司生產(chǎn)的核酸提取試劑（離心柱法）進(jìn)行核酸提取，請按照試劑說明書進(jìn)    行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑PRV-A 反應(yīng)液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，20μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle50℃10min否

21 cycle95℃2min否

345cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定（請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6.試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4.反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 國家市場監(jiān)督管理總局. GB/T 34756-2017 豬輪狀病毒病病毒 RT-PCR 檢測方法[S].