7
在外泌體western鑒定研究領(lǐng)域，NTA技術(shù)已被用作外泌體表征手段之一。相較于其他表征方式，NTA技術(shù)的樣本處理更簡單，更能保證外泌體原始狀態(tài)，檢測速度更快。大致方法是：將收集的外泌體用PBS稀釋至10^6/mL，用1 mL注射器注入納米顆粒跟蹤分析儀(如裝有450 nm激光器的Nanosight NS300顆粒粒度分析儀)；激光光束穿過樣本室外泌體顆粒，通過裝有攝像頭的顯微鏡實(shí)現(xiàn)顆粒可視化，捕捉外泌體的布朗運(yùn)動，利用愛因斯坦方程式根據(jù)其運(yùn)動計(jì)算濃度和流體力學(xué)直徑。SBI公司新開發(fā)的一種排除非外泌體顆粒干擾的試劑盒，還可幫助實(shí)現(xiàn)對完整外泌體的NTA分析。除了NTA以外，還有種動態(tài)光散射技術(shù)（DLS），其原理是：用一束激光打向存放樣品的容器，再在90°這樣一個(gè)角度去檢測散射光，得到散射光光強(qiáng)圖譜，通過對圖譜進(jìn)行時(shí)間相關(guān)分析；時(shí)間分析圖中開始衰減的地方就代表著外泌體的粒徑大小，但是缺少濃度信息；也就是說DLS其實(shí)就是通過對不同時(shí)間散射光強(qiáng)度的分析，從而得到外泌體相應(yīng)的粒徑。
掃描電鏡（SEM）的工作原理是用能量為1~30 KV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的二次電子和背散射電子成像，獲得試樣表面微觀組織結(jié)構(gòu)和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技術(shù)的發(fā)展，場發(fā)射電子槍的應(yīng)用得到普及，現(xiàn)代先進(jìn)的SEM的分辨率已經(jīng)達(dá)到1 nm左右，足夠用來進(jìn)行外泌體尺寸的測量。透射電鏡（TEM）是把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產(chǎn)生立體角散射。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關(guān)，因此可以形成明暗不同的影像，影像放大、聚焦后在成像器件(如熒光屏、膠片、感光耦合組件)上顯示出來。
外泌體western鑒定時(shí)通常會檢測哪些指標(biāo)蛋白？ 根據(jù)22篇外泌體相關(guān)文獻(xiàn)的統(tǒng)計(jì)，排在前4位的檢測指標(biāo)為CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、 CD9和CD81并列第三位（6/22）；接著檢測較多的4個(gè)指標(biāo)為Alix（4/22）、 HSP70(3/22)、 flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外還有一些指標(biāo)僅在1篇文獻(xiàn)中出現(xiàn)過，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。
針對外泌體的定性檢測至少選擇兩個(gè)指標(biāo)就能滿足文章發(fā)表需要了，比如檢測CD63和Tsg101。
外泌體western鑒定定性檢測中有沒有陽性對照？
從發(fā)表的文章來看，并沒有一篇文章結(jié)果中提到了陽性對照樣品，但是已經(jīng)被文獻(xiàn)報(bào)道的樣品可以作為后人Western blot檢測實(shí)驗(yàn)的陽性對照，通過這樣陽性樣品的檢測來判斷實(shí)驗(yàn)體系是否正常。羅列一下文獻(xiàn)中的陽性對照樣品：脂肪組織巨噬細(xì)胞外泌體、神經(jīng)干細(xì)胞外泌體、大鼠皮層神經(jīng)元外泌體、SCC-9和Cal-27細(xì)胞外泌體、MDA-MB-231外泌體、星型膠質(zhì)細(xì)胞外泌體、中性白細(xì)胞外泌體等。
外泌體western鑒定主要檢測指標(biāo)為CD63、CD9、CD81、Tsg101、Alix、HSP70等，針對外泌體的定性檢測，至少選擇2-3個(gè)指標(biāo)就能滿足文章發(fā)表就可以。大部分文獻(xiàn)中沒有檢測內(nèi)參，個(gè)別文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作為內(nèi)參進(jìn)行檢測，外泌體中的Actin、GAPDH和Tubulin的表達(dá)豐度相對于正常細(xì)胞樣品中的較低，可能會檢測不到任何條帶或者條帶微弱。
外泌體western鑒定操作步驟大致是：
用PBS重懸提取的外泌體，滴于孔徑2 nm的載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置2 min，用濾紙從濾網(wǎng)側(cè)邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液在室溫下負(fù)染5 min，濾紙吸干負(fù)染液，室溫晾干，電鏡觀察拍照。外泌體在電鏡下具有非常明顯的膜邊界、呈30~100 nm大小不一的茶托或杯狀結(jié)構(gòu)(也會有200 nm以下、較難鑒別的其他形狀的外泌體)，但電鏡對樣品的預(yù)處理和制備要求較高，樣品分離方法和樣品性質(zhì)可能影響電鏡結(jié)果的好壞；樣品的準(zhǔn)備階段比較復(fù)雜，不適合對外泌體進(jìn)行大量快速的測量；且因外泌體經(jīng)過了預(yù)處理和制備過程，無法準(zhǔn)確測量。
掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)或透射電鏡(transmission electron microscopy, TEM)等電子顯微鏡可用于外泌體鑒定。SEM的工作原理是用能量為1~30 KV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的二次電子和背散射電子成像，獲得試樣表面微觀組織結(jié)構(gòu)和形貌的高分辨率信息。由于超高真空技術(shù)的發(fā)展，場發(fā)射電子槍的應(yīng)用得到普及，現(xiàn)代先進(jìn)的SEM的分辨率已經(jīng)達(dá)到1 nm左右，足夠用來進(jìn)行外泌體尺寸的測量。TEM是把經(jīng)加速和聚集的電子束投射到非常薄的樣品上，電子與樣品中的原子碰撞而改變方向，從而產(chǎn)生立體角散射。散射角的大小與樣品的密度、厚度相關(guān)，因此可以形成明暗不同的影像，影像放大、聚焦后在成像器件(如熒光屏、膠片、感光耦合組件)上顯示出來。
以上兩種方法是常用的外泌體的鑒定方法，是展開外泌體功能研究的前提。比如在腫瘤研究中，通過提取鑒定不同細(xì)胞系中的外泌體，進(jìn)而通過PCR以及測序篩選分析RNA，探究外泌體在腫瘤進(jìn)展或者耐藥中的發(fā)生機(jī)制。
