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PCR實驗室被污染處理探究
閱讀：146 發(fā)布時間：2025-4-8有實驗室的地方，就不可避免的會出現(xiàn)實驗室污染。實驗室的污染，不僅會影響實驗與科研的質(zhì)量和效果,還對實驗室工作人員的身體健康有損害，現(xiàn)在來一起了解下PCR實驗室的污染原因及解決方法。
一、PCR實驗室污染分類：
標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導(dǎo)致彼此間的污染。
PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
PCR擴增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中主要-常見的污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。
還有一種容易忽視，可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。
實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見，因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。
二、 污染監(jiān)測
一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
對照試驗：
1、陽性對照：在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照，它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。
2、陰性對照：每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括①標本對照：被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照；被檢的標本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照。②試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監(jiān)測試劑是否污染。
3、重復(fù)性試驗。
4、選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增。
三、防止污染的方法
進行PCR操作時，操作人員應(yīng)該嚴格遵守一些操作規(guī)程，-大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。
劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現(xiàn)全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進行：
l 試劑準備區(qū)。
l 標本制備區(qū)。
l PCR擴增區(qū)及分析區(qū)。
切記：任何一間的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。
分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應(yīng)在生物安全柜、裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：
n PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；
n 引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產(chǎn)物區(qū)配制；
n 引物和dNTP應(yīng)分裝儲存，分裝時應(yīng)標明時間，以備發(fā)生污染時查找原因。
四、PCR實驗操作注意事項:
盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：
1）. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；
2）. 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；
3）. 避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；
4）. 操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精-確度；
5）. 后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；
6）. 操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性；
7）. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，-好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)；
8）. 重復(fù)實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。