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摘要本文介紹了安捷倫 1200 系列高分離度快速液相色譜儀（RRLC）配合安捷倫 6460A 三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀在人血漿生物分析中的應(yīng)用。高通量分析表現(xiàn)在：待測藥物和內(nèi)標(biāo)物都能夠在色譜中于 1 分鐘內(nèi)洗脫。超高靈敏度表現(xiàn)在：線性范圍涵蓋了人體血漿微劑量水平藥代動力學(xué)研究的典型濃度范圍（1–500 pg/mL 血漿濃度）。耐用性和重現(xiàn)性表現(xiàn)在：在上述濃度范圍，5 天之內(nèi)通過該LC/MS 系統(tǒng)可分析超過1000 個血漿樣品。

引言使用 LC/MS 定量分析生理樣本如血漿和血清中的藥物，可以認(rèn)為是藥物發(fā)現(xiàn)中藥代動力學(xué)（PK）研究的特征。通過 LC/MS分析得到的 PK 圖線提供了候選藥物的生物利用率和半衰期信息，以便比較并選出先導(dǎo)化合物用于進(jìn)一步研究。制藥行業(yè)需要靈敏度高、選擇性好、耐用性強(qiáng)的分析方法，同時還應(yīng)具有高通量，以便快速獲得這些信息并迅速作出判斷。由于由體外實(shí)驗(yàn)或動物實(shí)驗(yàn)的 PK 數(shù)據(jù)外推得到的人體劑量數(shù)據(jù)常常具有誤導(dǎo)性，出現(xiàn)了“first-in-human trial"（人體試驗(yàn)，即人體微劑量試驗(yàn)）的概念，因而對生物分析的靈敏度設(shè)置了更嚴(yán)格的要求，即人體微劑量水平實(shí)驗(yàn)的藥物用量必須要低于動物或體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蓄A(yù)期治療劑量的1/1001–8。目的為證實(shí)安捷倫 1200 系列高分離度快速液相色譜（RRLC）與安捷倫 6460A 三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)的高通量、超高靈敏度和耐用性而設(shè)計了本實(shí)驗(yàn)。人血漿中添加藥物的濃度設(shè)定在人體微劑量水平研究的典型范圍（1–500 pg/mL 血漿濃度）。在隨后的血漿檢測中，五個工作日內(nèi)完成了包含 1000 多個樣品的分析序列（例如每天進(jìn)樣 200 次）。每天的分析序列之后都用血漿中藥物的系列標(biāo)樣來評估系統(tǒng)性能。

實(shí)驗(yàn)儀器• 安捷倫 1200 系列 RRLC 系統(tǒng)，包括 SL二元泵、微量真空脫氣機(jī) 、SL 柱溫箱和SL 自動進(jìn)樣器。• 安捷倫 6460A 質(zhì)譜儀• 安捷倫 20 通多用途真空處理站• 安捷倫 SampliQ 優(yōu)化聚合物技術(shù)（OPT）萃取柱（30 mg）• 安捷倫 ZORBAX C18 Eclipse Plus 色譜柱 2.1 mm × 50 mm，1.8 µm• 安捷倫 Mass Hunter 工作站軟件，用于儀器控制、數(shù)據(jù)采集及數(shù)據(jù)處理LC 方法操作條件流動相 A 水 [0.1% 甲酸（FA）]流動相 B 乙腈（ACN）（0.1 % FA）梯度設(shè)置 t (min) %B0 300.1 300.95 601 601.01 901.20 901.21 30流速 0.8 mL/min柱溫 40 °C停止時間 1.5 min梯度平衡時間 2.5 min進(jìn)樣體積 8 µL洗針 10 s，乙腈/水 60:40 v/v(0.1% TFA)

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MS 方法操作條件掃描模式 采用 MRM MasshunterOptimizer 軟件獲得如表 1 中所示的優(yōu)化條件。離子化模式 結(jié)合安捷倫噴射流技術(shù)的ESI 正離子模式干燥氣溫度 300 °C干燥氣流速 11 L/min霧化器壓力 20 psi毛細(xì)管電壓 2000 V鞘氣溫度 400 °C鞘氣流速 12 L/min噴嘴電壓 0 V化學(xué)品人體血漿以及所有標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)品（去甲替林、曲米帕明、甲酸（FA）購于 Sigma-Aldrich 公司（德國）。HPLC級水購自 Burdick & Jackson 公司（美國），HPLC 級乙腈和甲醇購自 Merck 公司（德國）。血漿檢測校正標(biāo)樣：10 µL 去甲替林的參比標(biāo)樣（溶于乙腈/水 = 70:30，v/v）添加到 190 µL 人血漿中，用來配制空白溶液和在1 - 500 pg/mL 范圍內(nèi)的 6 個濃度的標(biāo)樣溶液，添加 400 µL 2% 甲酸和 20 µL 曲米帕明內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻。安捷倫 SampliQ OPT 固相萃取柱（30 mg）用 1 mL 甲醇和 1 mL 水（0.1% 甲酸）活化，加入樣品混合物后先后用 1 mL 0.1%磷酸和 1 mL 5% 乙腈溶液淋洗，然后用200 µL 乙腈/水 = 70:30（ v/v）洗脫，提取物用水稀釋 2 倍，使溶劑組成與流動相初始比例相似。血漿樣本按相同步驟進(jìn)行處理，4000 rpm 離心 5 分鐘后進(jìn)樣

結(jié)果與討論基質(zhì)效應(yīng)和回收率通過新型 SampliQ OPT 填料獲得的基質(zhì)效應(yīng)因子和回收率分別參考 Zweigenbaum等提出的公式（1）和（2）9,10。去甲替林標(biāo)樣配制兩個濃度：500 和 100 pg/mL，添加后的血漿和空白樣本，按前述血漿檢測方法進(jìn)行提取?？瞻滋崛∫航?jīng)緩速氮?dú)獯蹈珊笥脜⒈葮?biāo)樣重新溶解。通過這種方法，就可在已提取添加溶液、提取后空白添加溶液和參考標(biāo)樣中獲得相同的去甲替林濃度。將樣品以1 µL 體積重復(fù)進(jìn)樣兩次，取平均值進(jìn)行計算。去甲替林濃度為 500和 100 pg/mL 時回收率分別為 97% 和95%。基質(zhì)效應(yīng)因子為 0.8。內(nèi)標(biāo)物曲米帕明的結(jié)果與之相近。高通量 LC/MS 方法圖 1 是 SPE 提取物的典型 MRM 譜圖。在提取前血漿中去甲替林的濃度為 500 pg/mL。去甲替林和內(nèi)標(biāo)物在 1 分鐘內(nèi)可以洗脫下來，證明該 LC/MS 分析的高通量特性，使用色譜柱交替再生技術(shù)還可以獲得更高的通量。使用 RRLC系統(tǒng)，在進(jìn)行此類 PK 分析時，分析周期時間（包括進(jìn)樣、樣本分析、柱再生）可以低于1.5 分鐘11。