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干細胞增殖檢測：3H同位素滲入法
閱讀：109 發(fā)布時間：2018-4-18一、原理
干細胞在有絲分裂原PHA、ConA 等的刺激下，產(chǎn)生增殖反應，DNA和RNA合成明顯增加，如在培養(yǎng)液中加入3H－胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），則可被轉(zhuǎn)化中的細胞攝入。測定標記淋巴細胞的放射強度可反映淋巴細胞增殖的程度。
二、儀器和材料
RPMI-1640 細胞培養(yǎng)液、小牛血清、2-巰基乙醇（2-ME）、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A（ConA）、Hank's液、PBS緩沖液（pH7.2-7.4）、3H-TdR、閃爍液[2，5-二苯基惡唑（PPO）0.5g、1，4-雙-（5-苯基惡唑基）-苯（POPOP）0.25g、二甲苯500mL混勻]
200目篩網(wǎng)，96孔培養(yǎng)板（平底），手術(shù)器械、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺、液體閃爍儀、多頭細胞取集器、49型玻璃纖維濾紙。
三、實驗步驟
1、脾細胞懸液制備
無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾撕碎，制成單細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank's液洗3次，每次離心10min（1000r/min）。然后將細胞懸浮于2mL的*培養(yǎng)液中，用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)（應在95%以上），zui后用RPMI1640*培養(yǎng)液將細胞數(shù)調(diào)成5×106個/mL。
2、淋巴細胞增殖反應
將脾細胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中，200μL/孔，每一份脾細胞懸液分裝6個孔，3孔加ConA（5ug/mL），另3個孔不加ConA 作為對照。置5% CO2，37℃培養(yǎng)72h，培養(yǎng)結(jié)束前6h，每孔加入3H-TdR 20μL，使其終濃度為（3.7-18.5）×104Bq/mL。用多頭細胞收集器將細胞取集于玻璃纖維濾紙上。濾紙片充分干燥后置測量瓶中，加入7mL閃爍液，用液閃儀測定每分鐘脈沖數(shù)（cpm）。
3、干細胞數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值< F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。
以每分鐘脈沖數(shù)（cpm）表示增殖程度，用刺激指數(shù)（SI）來表示
實驗孔cpm
SI= ─────────
對照孔cpm
受試樣品組的SI值顯著高于對照組的SI值，即可判定該項實驗結(jié)果陽性。
Thiopental CIII 250mg 戊硫代巴比妥標準品 76-75-5
Thioridazine 200mg 硫利達嗪標準品 50-52-2
Thioridazine Hydrochloride 200mg 鹽酸硫利達嗪標準品 130-61-0
Thiostrepton 200mg 硫鏈絲菌素標準品 1393-48-2
Thiotepa 500mg 三亞乙基硫代磷酰胺標準品 52-24-4
Thiothixene 250mg 替沃噻噸標準品 3313-26-6
Thonzonium Bromide 200mg 通佐溴銨標準品 553-08-2
Thymol 500mg 百里酚標準品 89-83-8
Tiagabine Hydrochloride 300mg 鹽酸噻加賓標準品 145821-59-6
Tiagabine Related Compound A 15mg 噻加賓相關(guān)物質(zhì)A標準品
Tiamulin 100mg 泰妙菌素標準品 55297-95-5
Tiamulin Fumarate 250mg 延胡索酸泰妙菌素標準品 55297-96-6
干細胞