總膽固醇檢測試劑盒(比色法)（#STA-384）測量血清、血漿、裂解物、或組織樣本。該測定基于酶驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)，可量化膽固醇酯類和游離膽固醇。膽固醇酯通過膽固醇酯酶水解成膽固醇，然后被膽固醇氧化酶氧化成酮膽甾-4-烯-3-酮加氫過氧化物。然后用高度特異的比色探針檢測過氧化氫。辣根過氧化物酶催化探針與過氧化氫之間的反應(yīng)，過氧化氫與辣根過氧化物酶結(jié)合1:1的比例。將樣品與96孔中已知濃度的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較微量滴定板格式。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品孵育45分鐘，然后用標(biāo)準(zhǔn)96孔比色板讀數(shù)器。

艾美捷總膽固醇檢測試劑盒(比色法)（#STA-384）組成：

盒子1（室溫運(yùn)輸）：

1. 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品（部件編號(hào)239001）：一支50 µL管，含10 mM乙醇溶液中的膽固醇。

2. 檢測稀釋液（5倍）（部件編號(hào)239002）：一瓶100 mL。

3. 50倍比色探針（部件編號(hào)238401）：一支200 µL管，溶于DMSO中。

4. 辣根過氧化物酶（部件編號(hào)234402）：兩支100 µL管，含100 U/mL甘油溶液中的辣根過氧化物酶。

總膽固醇檢測試劑盒(比色法)特點(diǎn)：

1、96孔比色或熒光檢測格式

2、檢測低至4µM（比色法）或0.2µM（熒光法）的濃度

3、適用于血清、血漿、細(xì)胞懸浮液和組織勻漿

4、α-酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)品用于未知樣品的定量

樣本準(zhǔn)備：

樣本應(yīng)立即進(jìn)行檢測，或在檢測前儲(chǔ)存于-80oC。樣本的最佳實(shí)驗(yàn)條件需由研究者自行確定。以下建議僅作為指導(dǎo)方針，可根據(jù)需要調(diào)整以優(yōu)化或補(bǔ)充用戶的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。建議對樣本進(jìn)行一系列稀釋，以獲得最佳的檢測結(jié)果并盡量減少可能的干擾物質(zhì)。根據(jù)需要運(yùn)行適當(dāng)?shù)膶φ战M。始終與樣本一起運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線。高濃度的蛋白質(zhì)可能會(huì)干擾檢測。在這種情況下，建議使用10kDa分子量截止（MWCO）的離心過濾器對樣本進(jìn)行過濾，以減少蛋白質(zhì)干擾和渾濁的可能性。

- 組織樣本：稱取500-1000 mg樣本，用剪刀和研缽將其剪碎并研磨，直至組織w全液化。加入2 mL 1X檢測緩沖液或PBS，然后在冰上對勻漿進(jìn)行數(shù)次超聲處理。以12,000 x g離心10分鐘以去除雜質(zhì)。收集上清液，并在另一個(gè)離心管中再次離心以進(jìn)一步澄清。將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并在冰上孵育。準(zhǔn)備好用于檢測的樣本，并將剩余的上清液儲(chǔ)存于-80oC。在1X檢測緩沖液中進(jìn)行進(jìn)一步稀釋。

- 細(xì)胞懸浮液：將細(xì)胞制備成1x10?細(xì)胞/mL的濃度，并用0.2 mL冷PBS或1X檢測緩沖液快速勻漿細(xì)胞沉淀。以12,000 x g離心10分鐘以去除雜質(zhì)。將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并在冰上孵育。準(zhǔn)備好用于檢測的樣本，并將剩余的上清液儲(chǔ)存于-80oC。在1X檢測緩沖液中進(jìn)行進(jìn)一步稀釋。

- 血清：采集血液時(shí)不要使用抗凝劑。讓血液在室溫下凝固30分鐘。在4oC下以2000 x g離心10分鐘。小心地移除血清層，并將其置于冰上。注意避免干擾白色的白細(xì)胞層。分裝樣本用于檢測，并將剩余溶液儲(chǔ)存于-80oC。在1X檢測緩沖液中進(jìn)行血清稀釋。進(jìn)行多次稀釋以確保數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

- 血漿：使用肝素或檸檬酸（EDTA可能會(huì)導(dǎo)致猝滅效應(yīng)）采集血液，并在4oC下以1000 x g離心10分鐘。小心地移除血漿層，并將其置于冰上。注意避免干擾白色的白細(xì)胞層。分裝樣本用于檢測，并將剩余溶液儲(chǔ)存于-80oC。在1X檢測緩沖液中進(jìn)行血漿稀釋。進(jìn)行多次稀釋以確保數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

注意事項(xiàng)：

1. NADH濃度高于10 µM和谷胱甘肽濃度高于50 µM的樣本會(huì)氧化比色探針，可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的讀數(shù)。為了盡量減少這種干擾，建議在反應(yīng)中加入超氧化物歧化酶（SOD），最終濃度為40 U/mL。

2. 避免使用含有DTT或β-巰基乙醇的樣本，因?yàn)楸壬结樤诹虼迹ǜ哂?span style="font-family: Calibri;">10 µM）存在時(shí)不穩(wěn)定。

3. 比色探針在高pH（>8.5）條件下不穩(wěn)定。

結(jié)果示例：

肝勻漿。在冷1X試驗(yàn)中對雞肝進(jìn)行均質(zhì)化和超聲處理 緩沖器。離心后，根據(jù)測定方案對勻漿進(jìn)行測試。

相關(guān)產(chǎn)品：

1. STA-367：人載脂蛋白E ELISA試劑盒

2. STA-369：OxiSelect™人氧化LDL ELISA試劑盒（MDA-LDL定量）

3. STA-390：總膽固醇檢測試劑盒（熒光法）

4. STA-391：HDL和LDL/VLDL膽固醇檢測試劑盒

總膽固醇檢測試劑盒(比色法)引用文獻(xiàn)：

Cappello, A. et al. (2022). Extracellular serine empowers epidermal proliferation and psoriasis-like symptoms. Sci Adv. 8(50):eabm7902. doi: 10.1126/sciadv.abm7902 (#MET-5131).