556547 FITC偶聯(lián)Annexin-V凋亡檢測試劑盒用戶指南

——精準(zhǔn)檢測細(xì)胞凋亡的科研利器

一、產(chǎn)品概述

556547 FITC偶聯(lián)Annexin-V凋亡檢測試劑盒（貨號：556547）由美國BD公司（BD Biosciences）研發(fā)，基于Annexin V與磷脂酰絲氨酸（PS）的高親和力特性，通過FITC熒光標(biāo)記實現(xiàn)凋亡細(xì)胞的早期識別。該試劑盒適用于流式細(xì)胞術(shù)（FCM），可區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡/壞死細(xì)胞，是細(xì)胞凋亡研究的經(jīng)典工具。

二、技術(shù)規(guī)格

• 包裝規(guī)格：100測試/盒

• 儲存條件：2–8℃（短期）、-20℃（長期，避免反復(fù)凍融）

• 有效期：12個月（自生產(chǎn)日期起）

• 核心組分：

• Annexin V Binding Buffer（10×）：含HEPES、NaCl、CaCl?，用于維持PS外翻的離子環(huán)境。

• FITC Annexin V：分子量35–36 kDa，Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與暴露的PS結(jié)合。

• Propidium Iodide（PI）：核酸染料，僅能透過晚期凋亡/壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜。

三、核心優(yōu)勢

1. 高靈敏度

• FITC Annexin V可檢測PS外翻這一凋亡早期事件，早于DNA斷裂等核變化。

• 在Jurkat細(xì)胞凋亡模型中，可檢測到0.5%的早期凋亡細(xì)胞。

2. 多階段區(qū)分

• 活細(xì)胞：Annexin V?/PI?

• 早期凋亡：Annexin V?/PI?

• 晚期凋亡/壞死：Annexin V?/PI?

• 通過Annexin V與PI的聯(lián)合染色，可區(qū)分：

3. 操作簡便

• 無需固定細(xì)胞，15分鐘孵育即可完成染色，適配高通量篩選。

四、操作流程

（一）樣本準(zhǔn)備

1. 細(xì)胞收集：

• 懸浮細(xì)胞：1000 rpm離心5分鐘，棄上清。

• 貼壁細(xì)胞：用不含EDTA的胰酶消化，2000 rpm離心5–10分鐘，棄上清。

2. 洗滌：

• 用預(yù)冷的1×PBS（pH 7.4）重懸細(xì)胞，2000 rpm離心5分鐘，重復(fù)1次。

3. 濃度調(diào)整：

• 用1×Annexin V Binding Buffer調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?細(xì)胞/mL。

（二）染色

1. 試劑添加：

• 5 μL FITC Annexin V

• 5 μL PI（20 μg/mL）

• 取100 μL細(xì)胞懸液至流式管中，加入：

2. 孵育：

• 室溫避光孵育15分鐘。

3. 稀釋：

• 加入400 μL 1×Annexin V Binding Buffer，輕柔混勻。

（三）流式檢測

• 參數(shù)設(shè)置：

• FITC通道（Ex/Em：494/518 nm）檢測Annexin V

• PerCP/Cy5.5或ECD通道檢測PI

• 結(jié)果分析：

• Annexin V?/PI?：活細(xì)胞

• Annexin V?/PI?：早期凋亡細(xì)胞

• Annexin V?/PI?：晚期凋亡/壞死細(xì)胞

五、應(yīng)用案例

1. 腫瘤研究

• 在乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7）中，通過該試劑盒檢測到紫杉醇處理后早期凋亡細(xì)胞比例從5%升至35%。

2. 免疫學(xué)研究

• 發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞活化后48小時，Annexin V?/PI?細(xì)胞比例顯著增加，提示凋亡早期事件。

3. 藥物毒性評估

• 在肝細(xì)胞（HepG2）中，檢測到順鉑處理后晚期凋亡/壞死細(xì)胞比例從2%升至28%。

六、質(zhì)量控制與驗證

1. 批次一致性：

• Annexin V活性（≥95%）

• FITC熒光強度（CV≤5%）

• PI純度（HPLC驗證≥99%）

• 每批次試劑盒附帶CoA（Certificate of Analysis），包含：

2. 性能驗證：

• 使用Jurkat細(xì)胞系進行重復(fù)性測試（n=10），早期凋亡細(xì)胞檢測CV≤3%。

七、注意事項

1. 操作安全：

• FITC和PI為光敏物質(zhì)，需避光操作。

• PI有毒性，操作時需佩戴手套，避免接觸皮膚和黏膜。

2. 樣本處理：

• 避免過度消化貼壁細(xì)胞，推薦用不含EDTA的胰酶處理。

• 血液樣本需去除血小板，因其含PS可干擾結(jié)果。

3. 檢測時效：

• 染色后宜在1小時內(nèi)完成流式檢測，時間過長可能導(dǎo)致凋亡率偏高。