AD背景介紹
阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種發(fā)病原因不明、發(fā)病機制復雜的原發(fā)性腦部神經性疾病，是最為常見的癡呆類型之一。臨床主要表現(xiàn)為進行性記憶力下降、認知功能障礙、行為異常和人格失常等。其典型的病理改變包括神經元丟失、β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protenin, Aβ)沉淀形成的老年斑(senile plaque, SP)及tau蛋白過度磷酸化形成的神經纖維纏結(neurofibrillary tangle, NFT)等[1]。隨著人口老齡化進程的不斷加劇，AD已成為國內外關注的熱點和焦點。
圖1 a)健康大腦；b)AD大腦中的大腦和神經元的生理結構[2]
AD建模方法
目前常用的AD動物模型的制備思路主要以體現(xiàn)AD病理、生理、臨床表現(xiàn)特征為導向，模擬AD病理特征制備模型是研究AD的重要手段。AD動物模型的建立方法主要包括衰老模型、轉基因模型、外源性有害物質注入模型等(表1)。例如，研究人員建立了腦內直接注射Aβ以誘發(fā)Aβ沉積的老年斑為特點的AD模型。目前主要注射的Aβ為Aβ1-42、Aβ1-40以及Aβ25-35，注射部位主要為單/雙側海馬CA1區(qū)或者側腦室，注射時間可從3天到數(shù)周不等[3-4]。其中，Aβ1-42是AD病理學研究的主要形式，它形成的核（種子）啟動了纖維的形成，導致了經典的淀粉樣變性過程。
表1 常用AD動物模型的優(yōu)缺點比較
誘導原理 | 模型 | 優(yōu)點 | 缺點 |
衰老 | 自然衰老型 | 模型腦內神經元萎suo、膽堿能功能低下、認知障礙。 | 老齡動物難以大量獲得、極少神經元纖維纏結及淀粉樣蛋白沉積、造模時間長。 |
快速老化型(SAM) | Aβ沉積、葡萄糖代謝的三羧酸循環(huán)異常、免疫功能障礙。 | 成本高、壽命較短。 | |
D-半乳糖(D-gal)模型 | 價格低廉、神經元丟失、蛋白質合成減少、學習記憶障礙。 | 不能產生AD有的老年斑和神經纏結、不確定因素較多 | |
轉基因 | APP轉基因型 | 細胞外Aβ的沉積、神經炎斑塊、神經元突觸丟失。 | 無tau蛋白磷酸化及NFT，無AD海馬及皮層神丟失經元。 |
APP/PS-1轉基因型 | 皮質和海馬區(qū)有Aβ沉積、神經元的改變、神經行為學功能障礙。 | 外源性基因表達不穩(wěn)定，造模費時、繁殖力差,費用高。 | |
轉tau基因動物型 | 腦干和脊髓有NFT的形成、記憶障礙。 | 缺乏Aβ沉積 | |
外源性有害物質注入誘導 | Aβ注入誘導型 | Aβ沉積、免疫炎癥反應、星形膠質細胞增生、tau蛋自過度磷酸化，ChAT活性顯著下降。 | 不符合AD慢性起病的特點、Aβ聚集在注射位點局部，造模對腦組織造成非目的損傷。 |
鋁中毒誘導型 | Aβ聚集、神經元變性、空間學習障礙和記憶損傷。 | 造模周期較長、中樞膽堿能活性未降低、NFT不同于AD患者。 | |
鏈脲菌素(STZ)型 | tau蛋白高度磷酸化、Aβ沉積、膽堿能的缺失、氧化應激。 | 動物死亡率較高、無神經纖維纏結和老年斑。 | |
東莨菪堿誘導型 | 方法簡便易行、費用較低、膽堿能神經系統(tǒng)障礙、認知障礙。 | 缺乏AD典型病理特征 |
下面，小愛分享用Aβ 1-42誘導AD模型的方法[3]。
1、Aβ1-42的配制
(1) 取出儲存于-80°C條件下的人工合成Aβ1-42凍干粉，室溫下平衡30min；
(2) 在通風櫥內，將 Aβ1-42懸浮于100%HFIP(1.596g/mL)中，濃度為1mM，充分混勻后分裝成等量小份；
(3) 將分裝的等量小份用真空離心蒸發(fā)濃縮器蒸發(fā)掉HFIP，蒸發(fā)后-20°C保存；
(4) 使用前，將上述-20°C保存的小份Aβ1-42重懸于DMSO中，濃度為5mM；
(5) 使用時，按實驗需要用生理鹽水或者人工腦脊液稀釋至實驗濃度。
2、小鼠單側側腦室埋管
(1) 小鼠吸入異氟烷麻醉后，固定于小鼠腦立體定位儀上；
(2) 用75%酒精對頭部顱頂消毒，剃毛后再次消毒；
(3) 剪開頭皮，暴露顱骨，雙氧水去除顱骨表面的結締組織。顱骨干燥后，再次消毒；
(4) 利用立體定位儀將定位針指向前囟門(Bregma)并作為起始點，移動定位針確定套管位置（前囟前0.46mm、顱骨中線左右各旁開1mm、深2.3mm），用顱骨鉆鉆孔，左右側腦室隨機放置套管（套管直徑0.48mm、內芯直徑0.3mm）；
(5) 用骨膠粘合套管與顱骨之間的縫隙，骨膠干燥后用牙科水泥將套管固定在顱骨上；
(6) 將小鼠轉移至電熱毯上，蘇醒后放回飼養(yǎng)盒中，單籠單只飼養(yǎng)；
(7) 注射藥物時，拔出導管內芯，用適宜長度PE管連接小鼠腦部套管和微量注射針，微量注射泵注射速度為0.5μL/min。
3、行為學任務
任務開始前對各組已完成套管埋置的小鼠注射生理鹽水或者Aβ1-42，微量注射泵注射速度為0.5μL/min，注射2μL。注射完后停針5min防止注射液倒流，然后放回內芯，鎖緊螺帽。自發(fā)轉換Y迷宮實驗和新異位置識別任務：小鼠注射藥物10min后，開始自發(fā)轉換Y迷宮實驗和新異位置識別任務的檢測。
AD驗證方法
理想的模型應至少具備以下三個特征：
①具有AD的主要病理學特征：SP和NFP。
②出現(xiàn)AD的重要病理變化：神經元死亡、神經突觸丟失和星形膠質細胞增生等。
③出現(xiàn)認知功能障礙。
在AD的基礎研究和藥物發(fā)現(xiàn)中，小鼠模型是揭示生物學機制、驗證分子靶點和篩選潛在化合物的重要資源。轉基因和非轉基因小鼠模型都可以在體內獲得不同類型的AD樣病理。盡管有大量關于AD致病途徑的遺傳和生化研究，但作為一種以認知障礙為主要特征的疾病，任何干預措施的最終讀數(shù)都應該是學習和記憶的檢測[4]。
AD小鼠模型行為分析常用的測試實驗包括：情境恐懼條件反射、放射臂水迷宮和Morris水迷宮(圖2&3&4)。下面小愛以文獻[4]為例，詳細介紹情境恐懼條件反射實驗設備及操作步驟。
小鼠在一個調理室中進行單獨測試(圖2)，該調理室位于一個帶有透明有機玻璃窗口的音效衰減箱中，可以對實驗進行視頻記錄。調整室有一個36bar的隔震格柵地板，地板是可拆卸的，在每個實驗對象之后，用75%的乙醇清洗，然后再用水清洗。為了提供背景白噪聲(72dB)，在音量衰減室的一側安裝了單個計算機風扇。
在行為實驗之前，每天處理一次小鼠，連續(xù)3天。試驗室里一次只放一只動物。將其放置在調理室中2min，然后以2800Hz和85dB的頻率發(fā)出離散音調(CS)30s。在音調的最后2s內，鼠標通過地板條受到腳部電擊（US，0.50-0.80mA，持續(xù)2s），可調節(jié)足部電擊的強度來引發(fā)更強的記憶。在CS/US配對之后，將小鼠在調理室中再放置30s，然后將其放回籠子中。凍結行為可以通過使用專用軟件進行評分。根據(jù)經驗，通過手動評分凍結時間進行雙重檢查非常有用。訓練24h后，將小鼠放回條件反應室。凍結時間為連續(xù)5min。在訓練后36h將小鼠更換為條件箱。通過插入一個三角形籠子來創(chuàng)造一個新的環(huán)境，籠子的地板是光滑的，帶有香草氣味。2min后（CS前測試），將小鼠暴露在與訓練中使用的音調特征相同的音調中3min（CS測試），并測定凍結時間。通常在每種情況下使用15-20只動物。
在測試恐懼記憶的過程中需要進行的一個重要控制是感覺閾值評估。對電擊的感官知覺的改變可能是由于實驗操作導致對觀察到的表型記憶的錯誤歸因。將一系列單腳電擊傳遞給放置在恐懼條件所用相同電網上的動物。最初，0.1mA的電擊持續(xù)1s，評估動物的退縮、跳躍和發(fā)聲行為。每隔30s，沖擊強度增加0.1-0.7mA，然后每隔30s以0.1mA的增量恢復到0mA。通過平均每只動物對足部電擊表現(xiàn)出行為反應的電擊強度，對每只動物的發(fā)聲、退縮和跳躍閾值進行量化。
AD的治療
據(jù)報道，目前全球阿爾茨海默病病例約為2400萬例，2050年，癡呆癥患者總數(shù)估計將增加4倍。盡管AD是一個公共衛(wèi)生問題，但到目前為止，只有兩類藥物被批準用于治療AD，包括膽堿酯酶抑制劑（天然衍生、合成和雜交類似物）和N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗劑[5]。
AD的幾個生理過程會破壞乙酰膽堿生成細胞，減少膽堿能通過大腦的傳遞。乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEIs)分為可逆性、不可逆性和偽可逆性，通過阻斷膽堿酯酶(AChE)和丁基膽堿酯酶(BChE)分解ACh，導致突觸間隙中ACh水平增加而發(fā)揮作用。另一方面，NMDAR的過度激活導致內流的鈣離子水平增加，從而促進細胞死亡和突觸功能障礙。NMDAR拮抗劑阻止NMDAR谷氨酸受體的過度激活，從而阻止鈣離子內流，并恢復其正?；顒?。盡管這兩類藥物有療效，但它們只對治療阿爾茨海默病的癥狀有效，但不能治愈或預防這種疾病。
圖5 已被批準用于治療AD的小分子藥物化學結構式
建立理想的動物模型模擬人類疾病狀態(tài)有利于開展AD病因、發(fā)病機制及防治的深入研究。目前由于無法建立很好的AD動物模型，所以在進行藥物篩選時，同時用兩種或兩種以上AD動物模型比用單一模型更有說服力，同時也可進一步證實藥物的有效性。
參考文獻
[1] Puzzo D, Gulisano W, Palmeri A, et al. Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery[J]. Expert opinion on drugdiscovery, 2015, 10(7):703-711.
[2] Breijyeh Z, Karaman R. Comprehensive Review on Alzheimer's Disease: Causes and Treatment [J]. Molecules, 2020, 25, (24).
[3] 呂君妍. Aβ1-42或Aβ1-15改善APP/PS1/Tau轉基因阿爾茨海默癥小鼠記憶的機制[D]. 華東師范大學, 2023.
[4] A D P, B L L, A A P,et al.Behavioral assays with mouse models of Alzheimer's disease: Practical considerations and guidelines-ScienceDirect[J]. Biochemical Pharmacology, 2014, 88( 4):450-467.
[5] Breijyeh Z, Karaman R,Comprehensive Review on Alzheimer's Disease: Causes and Treatment[J]. Molecules, 2020, 25:5789
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abs45151799 | Amyloid β-Protein(25-35) | 1mg |
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