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多色類器官寶典:肺癌類器官的培養(yǎng)與多色鑒定

閱讀:1182      發(fā)布時間:2023-5-17
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一、肺癌類器官構建——Organotial人肺癌類器官培養(yǎng)基試劑盒(abs9443)

(1)取材后的組織須放在預冷的(2-8°C)組織保存液的取樣瓶中,快速轉運至潔凈實驗室進行組織處理和細胞分離,拍照并登記信息。

(2)準備若干培養(yǎng)皿,加入 4℃預冷的原代培養(yǎng)緩沖液備用。

(3)取樣瓶消毒,將組織放入培養(yǎng)皿中,利用原代培養(yǎng)緩沖液清洗三次后,去除雜質,利用眼科剪或手術刀將組織剪切成體積約為1-3mm3的組織塊。

(4)組織用人肺癌原代組織消化液消化,37℃震蕩消化10-20min(消化過程中隨時觀察消化情況)。

(5)取少量液體在顯微鏡下觀察,鏡下觀察到較多的單個細胞或70um以下的細胞簇后,加入三倍體積原代培養(yǎng)緩沖液終止消化。

(6)使用100um孔徑的篩網(abs7009)進行過濾,將濾液收集后,于300g富集離心5min后移去上清,添加原代培養(yǎng)緩沖液重新重懸離心。

(7)基質膠計算:第6步后觀察收集到的組織體積,添加25倍組織體積的基質膠(abs9495)重懸鋪板。

(8)24孔細胞培養(yǎng)板為例,每孔點膠25ul組織基質膠混合物進行鋪板(4℃下操作)。

(9)將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠,添加人肺癌類器官培養(yǎng)基(恢復室溫)進行培養(yǎng)。

 

二、多——六色多重熒光免疫組化染色試劑盒(abs50014)

(1)樣本制備:類器官樣本制備,參考類器官實操大本營之——固定包埋
(2)烤片:60℃烤片30min。
(3)脫蠟、水化:二甲苯(5min)——二甲苯(5min)——二甲苯(5min)——100%乙醇(5min)——100%乙醇(5min)——95%乙醇(3min)——85%乙醇(3min)——75%乙醇(3min)——去離子水(5min)。
(4)抗原修復:取200ml抗原修復液,加入染色盒中,將組織切片置于染色盒內耐高溫塑料切片架上,置于高壓鍋內加熱至飽壓,然后繼續(xù)加熱5min,關閉電源,10min后取出染色盒,室溫冷卻30min,畫上阻水圈,置入PBST浸洗3次,每次3min。
(5)阻斷內源性過氧化物酶:每切片加100μL3% H2O2,室溫下孵育10min,PBST浸洗3min×3次。
(6)封閉:除去PBST液,每張切片加100μL 5% 山羊血清封閉液,室溫孵育30min,除去封閉液。
(7)一抗孵育:每張切片加100μL一抗工作液,室溫保濕孵育1h,PBST浸洗3min×3次。
(8)二抗孵育:除去PBST,每張切片加100μL二抗,室溫保濕孵育15min,PBST浸洗3次,每次3min。
(9)染料孵育:除去PBST,每張切片加100μL現配的1*染料工作液(使用信號放大液按1:100稀釋),孵育10min后,置入PBST內洗滌,室溫浸片洗滌3次,每次3min。
(10)抗體洗脫:抗體洗脫液(abs994)37℃ 預熱,滴加少量抗體洗脫液覆蓋樣本,室溫放置3~5min;棄去洗脫液,再次滴加足量的洗脫液覆蓋樣本,37°C 孵育20min;PBST浸洗3次,每次3min。
(11)重復步驟(6)-(10),直至所有目標抗體染色完成。
(12)核染:滴加1*DAPI工作液到樣品上,浸沒樣本區(qū)域,室溫孵育10min后,用1*PBST浸洗玻片3次,每次2min。
(13)封片:滴加抗熒光淬滅封片劑,用蓋玻片封片,避免氣泡。
(14)掃描成像,數據分析。

 

Absin肺癌類器官多色風采展


 

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品名

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