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qPCR反應(yīng)之你問我答

閱讀：1375 發(fā)布時間：2023-1-11

實(shí)時定量PCR技術(shù)（real-time PCR）也叫qPCR（Quantitave PCR），是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過特定數(shù)學(xué)原理對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。它是一項(xiàng)臨床上非常成熟的技術(shù)，目前在分子生物學(xué)領(lǐng)域，qPCR核酸定量好方法。目前仍在全球肆虐的SARS-CoV-2鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)"——核酸檢測就是通過qPCR原理進(jìn)行的。

圖1 qPCR技術(shù)原理簡圖（圖片來自henrik's lab）

那么拿到一個樣本，需要經(jīng)過以下多項(xiàng)操作流程才能定量檢測到它的核酸含量。其中任何一個步驟操作失誤都會導(dǎo)致它的檢測結(jié)果出現(xiàn)異常，那讓小愛來帶您來看下出現(xiàn)常見問題的解答，為您解決qPCR實(shí)驗(yàn)中的痛點(diǎn)！

圖2 qPCR實(shí)驗(yàn)操作流程圖

FAQ:

1、無Ct值出現(xiàn)
a) 檢測熒光信號的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時采集，探針法則一般在退火結(jié)束時或延伸結(jié)束采集信號。
b) 引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性。
c) 模板量不足：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
d) 模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。
e) 反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在35個循環(huán)以上，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加循環(huán)，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號。

2、Ct值出現(xiàn)過晚
a) 擴(kuò)增效率極低：優(yōu)化反應(yīng)條件，嘗試三步法擴(kuò)增程序，或者重新設(shè)計引物。
b) 模板濃度太低：減少稀釋度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
c) 模板降解：重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
d) PCR產(chǎn)物太長：一般將PCR產(chǎn)物長度設(shè)計為100 bp-200 bp之間。
e) 反應(yīng)體系中存在PCR反應(yīng)抑制劑：一般為加入模板時帶入，導(dǎo)致模板質(zhì)量不高，加大模板稀釋倍數(shù)或者重新制備模板重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

3、陰性對照出現(xiàn)明顯擴(kuò)增
a) 反應(yīng)體系組分（如水）被污染：實(shí)驗(yàn)過程中，更換新的Mix或者水重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
b) 標(biāo)本間的交叉污染或產(chǎn)物污染：反應(yīng)體系在超凈工作臺內(nèi)配制，對實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格的區(qū)分，減少氣溶膠污染；使用帶濾芯的槍頭。
c) 引物二聚體的出現(xiàn)：引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
d) 引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。在35循環(huán)后陰性對照出現(xiàn)擴(kuò)增屬正常情況，可配合熔解曲線進(jìn)行分析。

4、熔解曲線出現(xiàn)多峰
a) 非特異性擴(kuò)增。
b) 引物設(shè)計不佳：避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。
c) 引物濃度不佳：適當(dāng)調(diào)整引物濃度。
d) 退火溫度低：提高退火溫度。
e) 模板中有基因組DNA的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的污染（DNaseI處理），或通過設(shè)計引物避免非特異性擴(kuò)增。

5、出現(xiàn)引物二聚體
a) 優(yōu)化擴(kuò)增條件，如提高退火溫度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。通常兩步循環(huán)(由95℃變性步驟直接進(jìn)入60℃退火和延伸步驟)有利于強(qiáng)效擴(kuò)增，因此引物設(shè)計時設(shè)定的成功退火溫度為60°C。
b) 引物濃度太高，適當(dāng)降低引物濃度。
c) 可通過瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)引物二聚體。引物二聚體在凝膠的底部形成擴(kuò)散條帶，通常位于100 bp以下。

6、擴(kuò)增效率低
a) 反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
b) 反應(yīng)條件不佳：適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。
c) 反應(yīng)體系中有抑制物：一般為模板中引入，應(yīng)先把模板適當(dāng)稀釋，再加入到體系中，減少抑制物的影響。

7、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差
a) 加樣體積失準(zhǔn)：使用性能較好的移液槍，擴(kuò)大反應(yīng)體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應(yīng)體系中。
b) 定量PCR儀不同位置溫度控制不一致：定期校準(zhǔn)儀器。
c) 模板濃度太低：模板濃度越稀，重復(fù)性越差，減少模板稀釋度或提高加樣體積。
d) qPCR mix沒有混勻，請使用前充分混勻。

除了實(shí)驗(yàn)操作的解答外，愛必信擁有全套qPCR解決方案來一站式幫您解決qPCR實(shí)驗(yàn)難題。

愛必信qPCR全套解決方案推薦產(chǎn)品

類別	貨號	產(chǎn)品名稱	規(guī)格
樣本保存	abs9268	RNA樣品保存液	100mL
樣本保存	abs60330	RNA保護(hù)因子	50T
RNA提取純化	abs9331	Trizol(總RNA抽提試劑)	100mL
	abs60027	組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒(Dnase I)	50T
	abs60030	病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒	50T
	abs60028	植物RNA快速提取試劑盒(DNase Ⅰ)	50T
	abs60029	全血RNA快速提取試劑盒(Dnase I)	50T
逆轉(zhuǎn)錄	abs60073	Reverse Transcriptase	10000U/10000U×5
	abs60076	Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)	50T/100T
	abs60246	逆轉(zhuǎn)錄一管化三代預(yù)混液	100T
qPCR	abs60309	一步法超級多重?zé)晒舛縋CR試劑盒(探針)	100T/250T
	abs60310	一步法超級熒光定量PCR試劑盒(探針)	100T/250T
	abs60093	Multiplex Probe One Step qRT-PCR Kit	100T/500T
	abs60086	SYBR High-Sensitivity qPCR SuperMix	1mL×5/1mL×25
	abs60087	SYBR qPCR SuperMix Plus(High ROX Premixed)	1 mL×5/1mL×25
	abs60088	SYBR qPCR SuperMix Plus(Low ROX Premixed)	1 mL×5/1mL×25
	abs60247	抗體染料法定量PCR預(yù)混液(通用ROX)	5×1mL
	abs60303	染料法熒光定量PCR試劑盒(化學(xué)修飾)	100T/200T/500T
	abs60304	染料法熒光定量PCR試劑盒(抗體修飾)	100T/200T/500T
	abs60305	探針法熒光定量PCR試劑盒	100T/200T/500T
	abs60306	UDG探針法熒光定量PCR試劑盒(防污染系統(tǒng))	100T/200T/500T
	abs60307	超級多重?zé)晒舛縋CR試劑盒(探針)	100T/200T/500T
	abs60308	UDG多重探針法熒光定量PCR試劑盒(防污染系統(tǒng))	100T/200T/500T

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