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導(dǎo)讀

l                      梯度延遲體積概念及對(duì)分析的影響

2023年4月，國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布“關(guān)于通則0512高效液相色譜法修訂草案的公示（第一次）”。2023年9月，國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布“關(guān)于通則0512高效液相色譜法修訂草案的公示（第二次）”。

在公示稿中，提到如梯度微調(diào)后仍不能滿足系統(tǒng)適用性要求，通常應(yīng)考慮滯留體積（也稱延遲體積）的緣故或更換色譜柱。

梯度延遲體積：是指從流動(dòng)相混合點(diǎn)至柱入口之間的體積，影響延遲體積的參數(shù)包括泵、混合器，進(jìn)樣器，最后到色譜柱，以及連接系統(tǒng)各部件的接頭。梯度洗脫中延遲體積非常重要，特別是復(fù)雜樣品的分析，低的延遲體積具有更快的梯度響應(yīng)時(shí)間，同一樣品在同一色譜柱上能夠獲得更好的分辨率。

若在實(shí)際使用中與方法開發(fā)時(shí)延遲體積有較大差異，會(huì)顯著影響梯度響應(yīng)時(shí)間，從而導(dǎo)致色譜分析中分離度、保留時(shí)間、相對(duì)保留時(shí)間受到顯著影響。如在中藥特征圖譜、一標(biāo)多測(cè)項(xiàng)目中相對(duì)保留時(shí)間作為常見評(píng)價(jià)指標(biāo)，若相對(duì)保留時(shí)間超出規(guī)定值范圍，可以將延遲體積差異作為考慮因素。

l                      中國(guó)藥典、歐洲藥典及美國(guó)藥典解決思路

在本次公示稿中，提到應(yīng)考慮方法開發(fā)時(shí)的系統(tǒng)與實(shí)際使用系統(tǒng)之間滯留體積的差異，在開始梯度程序前增加一個(gè)等度平衡階段，通過調(diào)整等度階段時(shí)間來調(diào)整梯度時(shí)間點(diǎn)，以與所使用的分析設(shè)備相適應(yīng)。

美國(guó)藥典與歐洲藥典在液相色譜法通則中均提到梯度延遲體積對(duì)梯度分析的影響，解決思路各國(guó)藥典保持一致。

延遲體積解決辦法

1. 選擇延遲體積接近的儀器，但標(biāo)準(zhǔn)制定時(shí)系統(tǒng)往往是未知的。

2. 更換硬件配置，但操作較為繁瑣。

3. 截止進(jìn)樣功能，島津液相色譜工作站內(nèi)置設(shè)置截止環(huán)模式，操作簡(jiǎn)便。

4. 調(diào)整梯度起點(diǎn)功能，島津液相色譜工作站可選擇進(jìn)樣前和進(jìn)樣后兩種模式，操作簡(jiǎn)便。

典型應(yīng)用案例

1、梯度起始點(diǎn)調(diào)整（進(jìn)樣前）  遠(yuǎn)志配方顆粒特征圖譜

從遠(yuǎn)志配方顆粒驗(yàn)證結(jié)果看，標(biāo)準(zhǔn)模式下，峰4實(shí)測(cè)RRT偏差大于標(biāo)準(zhǔn)要求的±10%。梯度起點(diǎn)調(diào)整（進(jìn)樣前500 µL）后，峰4實(shí)測(cè)RRT偏差小于±10%，且其他峰結(jié)果更優(yōu)。

2、梯度起始點(diǎn)調(diào)整（進(jìn)樣后）  野菊花配方顆粒特征圖譜

標(biāo)準(zhǔn)模式下，實(shí)測(cè)RRT偏差在 -9.77~0.24%之間。梯度起點(diǎn)調(diào)整后，實(shí)測(cè)RRT偏差在 -6.74~0.12%之間，RRT得到改善。

3、截止環(huán)功能進(jìn)樣   首烏藤配方顆粒特征圖譜

正常進(jìn)樣條件下，峰1的RRT大于10%，使用截止環(huán)進(jìn)樣后所有峰的RRT均在±10%之內(nèi)，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

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