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純水服務(wù)于流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行植物生殖細(xì)胞學(xué)研究
點擊次數(shù)：2578 發(fā)布時間：2015-5-10
流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展
流式細(xì)胞術(shù)zui初是開發(fā)應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的，但是隨后逐漸演變成了細(xì)胞計數(shù)、分類以及生物標(biāo)記探測等不同領(lǐng)域內(nèi)的有利工具[7]。盡管相關(guān)的*篇采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行植物細(xì)胞核分析的文章發(fā)表于1973年[8]，但是采用流式細(xì)胞術(shù)所開展的植物DNA分析在上世紀(jì)80年代末才獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，從此所有研究人員都開始堅定地在植物研究領(lǐng)域使用該項技術(shù)?；旧?，植物學(xué)家都是使用流式細(xì)胞術(shù)來測定植物細(xì)胞核中的DNA含量。有關(guān)流式細(xì)胞術(shù)詳細(xì)的原理及應(yīng)用的描述，請參閱參考文獻(xiàn)9。
圖2a概括表示了流式細(xì)胞儀如何通過電子檢測設(shè)備用一束水動力集中的液體流對經(jīng)染色的或靶向的粒子（尺寸介于0.2μm-150μm[7]）進(jìn)行懸浮排列。在植物研究中，先用熒光標(biāo)記物（比如：DAPI[4’,6-二脒基-2-苯基吲哚]或碘化丙啶）對細(xì)胞核（比如：粒子）進(jìn)行染色。然后，每一個懸浮的細(xì)胞核暴露于光束（通常為激光或UV燈光）之中，于是光的路徑被分散并由檢測器感知，用于分析每一個單獨(dú)粒子的熒光強(qiáng)度，為核酸中DNA含量的測定提供信息。成千上萬個完整細(xì)胞核的合并數(shù)據(jù)可為單獨(dú)組織的DNA含量提供信息（參見圖1中的波峰）。由于每一秒鐘幾乎會同時進(jìn)行分析多達(dá)數(shù)千個粒子的物理和/或化學(xué)特征，因此用于樣品分離和樣品檢測的溶液的質(zhì)量和純度非常關(guān)鍵。
如果使用的是低品質(zhì)或不合適的水供應(yīng)系統(tǒng)，則出現(xiàn)的不屬于樣品的污染物顆粒會發(fā)生熒光反應(yīng)并產(chǎn)生“噪聲"，這會干擾檢測結(jié)果并導(dǎo)致zui終錯誤的評估。因此，實驗時必須要使用高品質(zhì)的超純水。
超純水系統(tǒng)生產(chǎn)的超純水達(dá)到ASTM I級品質(zhì)
能夠生產(chǎn)出達(dá)到ASTM I級品質(zhì)超純水的超純水系統(tǒng)由賽多利斯（哥廷根，德國）提供。使用arium? pro VF水系統(tǒng)生產(chǎn)的超純水（ArUPH2O）進(jìn)行流式細(xì)胞分析，為了評估超純水對分析結(jié)果的質(zhì)量所產(chǎn)生的影響，作者檢查了兼性孤雌生殖的被子植物用于生產(chǎn)種子的繁殖途徑。這是通過比較分別采用ArUPH2O和標(biāo)準(zhǔn)鞘液溶液（0.04%*， 0, 01%去污劑）對樣品進(jìn)行檢測所獲得的結(jié)果而實現(xiàn)的（Partec GmbH）。
arium? pro VF系統(tǒng)（圖3）從經(jīng)過預(yù)處理的飲用水中通過去除所有污染微粒而生產(chǎn)出超純水。超純水的生產(chǎn)需要持續(xù)循環(huán)和一個恒定的水流速率，這可以通過一個帶壓力控制功能的泵系統(tǒng)來實現(xiàn)。在進(jìn)水端口和下游端口，或者產(chǎn)水端口進(jìn)行電導(dǎo)率的測定。
本文所描述的測試用arium? pro VF水系統(tǒng)（老一代與當(dāng)前的新一代arium? pro VF水系統(tǒng)有著*相同的技術(shù)設(shè)計，如圖3所示）通過兩支不同的濾芯來工作。這兩支濾芯裝填有特殊的活性炭吸附劑和混床離子交換樹脂，用以生產(chǎn)總有機(jī)活性炭（TOC）含量極低的超純水。此外，系統(tǒng)還有一個集成的UV燈，在波長為185nm和254nm時分別具有氧化有機(jī)物和殺菌效果。
除此之外，arium? pro VF超純水系統(tǒng)有一個內(nèi)置的作為切向流過濾器使用的超濾模塊。該過濾器中整合的超濾膜可截留膠體、微生物、內(nèi)毒素、RNA以及DNA等。出水端口安裝有一個0.2μm的終端過濾器，用以去除超純水生產(chǎn)后分配過程中的微粒和細(xì)菌。該設(shè)備生產(chǎn)純水的工藝流程請參閱圖4。
材料與方法
種子樣品來源于六倍體毛茛屬植物，在自由授粉的條件下進(jìn)行挑選收集。種子個體在塑料有蓋培養(yǎng)皿內(nèi)用300μl的提取緩沖液（CyStain UV Precise P, Partec GmbH）進(jìn)行碾碎，然后在室溫下孵育10分鐘，再將細(xì)胞核過濾（30μl漿狀物，CellTric?, Partec GmbH）至一個5-mL的塑料管中。而后，加入1.2mL染色緩沖液（CyStain UV Precise P），60秒后，樣品進(jìn)入流式細(xì)胞儀（CyFlow Space，Partec GmbH；參見圖2b）的藍(lán)色熒光通道進(jìn)行分析。更多內(nèi)容 ?
結(jié)果
總共有61個單獨(dú)種子重建了繁殖途徑。根據(jù)建議的標(biāo)準(zhǔn)程序，30個種子使用鞘液懸浮，31個種子使用ArUPH2O（電導(dǎo)率： 0.055μs/cm或18.2MΩ×cm電阻補(bǔ)償至25℃）懸浮。平均每個樣品測試了2329個細(xì)胞核，占總計數(shù)粒子的73%，而其它27%表現(xiàn)為細(xì)胞周期G2階段的細(xì)胞核或者背景信號。針對所有被分析的種子，全部要根據(jù)每個峰所富集的平均總數(shù)來計算胚胎和胚乳的平均峰位置。更多內(nèi)容 ?
討論
總之，所獲得的測試結(jié)果中具有極小的差異，這證實了arium系統(tǒng)是適用于植物材料相對倍性分析的快速又經(jīng)濟(jì)的選擇。高品質(zhì)的arium超純水水被證明用于實現(xiàn)流失細(xì)胞種子篩選技術(shù)上的可重現(xiàn)結(jié)果是非常有效的。盡管如此，由于抗生素和去污劑之類的添加劑具有可阻止生物膜的形成，以及增加容器、管道、閥門以及流動腔內(nèi)表面的濕度等作用，對流失細(xì)胞系統(tǒng)的可靠操作會造成長期或短期的正面影響，因此供應(yīng)商一般會建議在自制的鞘液中添加此類物質(zhì)。
簡而言之，ArUPH2O可即時用于植物細(xì)胞的流式細(xì)胞技術(shù)。由于流失細(xì)胞技術(shù)在其它應(yīng)用中越來越重要，比如腫瘤細(xì)胞的檢測，細(xì)胞的定量測定與形態(tài)分化，細(xì)胞周期分析，DNA-RNA含量估算，以及凋亡檢測等等，ArUPH2O的全面適用性為arium超純水在一系列使用流式細(xì)胞術(shù)的新興技術(shù)中的應(yīng)用創(chuàng)造了新機(jī)會。