文獻(xiàn)背景
冠狀動脈閉塞引起的心肌梗死（MI）是心血管疾病致殘和死亡的主要原因。炎癥和炎性細(xì)胞浸潤是心肌損傷的重要指標(biāo)。在心肌梗死早期，大量的炎性細(xì)胞被招募并分泌多種炎癥介質(zhì)，加劇了心肌損傷。心肌梗死后適當(dāng)應(yīng)用抗炎治療可能是其治療的關(guān)鍵步驟。
雷公藤甲素（TPL）是從中藥雷公藤中分離得到的具有藥理活性的化合物，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能?；赥PL在心血管疾病中的治療應(yīng)用，TPL可能對MI有良好的治療效果。然而，TPL全身給藥可能會引起肝腎毒性，可通過原位注射在心臟內(nèi)局部緩釋來解決TPL肝腎毒性問題。聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）是一種可生物降解的共聚物。PLGA納米顆?？梢园鞣N藥物，提高生物利用度并提供持續(xù)的藥物釋放，但PLGA納米顆粒的缺點(diǎn)之一是會發(fā)生藥物突釋，并且在突釋階段過度釋放藥物可能是有毒的。水凝膠是心臟組織工程中常用的材料，也是心肌組織修復(fù)藥物緩釋的良好平臺，因此可以考慮構(gòu)建水凝膠和PLGA納米顆粒雙重緩釋平臺。Pluronic F127是一種由聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷（PEO-PPO-PEO）組成的共聚物，可在體溫下轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)，在較低溫度下保持液態(tài)。F127水凝膠中的藥物通常會在4天內(nèi)釋放，可以防止PLGA納米顆粒在藥物釋放初期的藥物突釋。
該研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評估了TPL抗心肌梗死的可能性和機(jī)制，作者設(shè)計(jì)了由TPL@PLGA和Pluronic F127組成的雙重緩釋系統(tǒng)（TPL@PLGA@F127）。TPL@PLGA納米顆粒可在水凝膠中充分分散，實(shí)現(xiàn)TPL的長期釋放。TPL@PLGA@F127可避免PLGA引起的藥物突然釋放，為TPL治療提供可持續(xù)的支持。最后通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)評估了早期（MI術(shù)后3天）和后期（MI術(shù)后28天）對MI的影響以及早期對正常器官的毒性（流程圖如下）。
流程圖
基本信息
摘要
冠狀動脈閉塞導(dǎo)致的心肌梗死（MI）是全球心血管致殘和致死的主要原因?？寡字委熢贛I治療中發(fā)揮著重要作用。雷公藤甲素（TPL）作為一種中藥單體，具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能。但研究證明TPL水溶性差，具有明顯的肝腎毒性，因此制備水凝膠平臺（TPL@PLGA@F127），通過心肌內(nèi)注射測試了其在MI早期（MI術(shù)后3天）對正常器官的作用和毒性。結(jié)果表明TPL@PLGA@F127不僅能在心肌梗死術(shù)后第3天促進(jìn)巨噬細(xì)胞的"修復(fù)"極化（向M2巨噬細(xì)胞極化），而且在MI后期（MI術(shù)后28天）具有持久的抗炎作用。TPL@PLGA@F127可以更緩慢、更穩(wěn)定地釋放TPL減輕其毒性。通過觀察TPL@PLGA@F127對MI的長期影響，發(fā)現(xiàn)其具有改善心功能、抑制心肌纖維化、保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。綜上所述，TPL@PLGA@F127不僅能增強(qiáng)TPL對MI的治療效果，還能減輕肝毒性和腎毒性，為TPL治療MI的臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1.TPL抗心肌梗死的網(wǎng)絡(luò)藥理分析
從數(shù)據(jù)庫（GeneCards、DrugBank、OMIM、CTD）和藥物數(shù)據(jù)庫（TCMSP、GeneCards）中分別獲得2005個與MI相關(guān)的基因和227個與TPL相關(guān)的基因，通過基因之間的相互作用獲得了126個與MI治療相關(guān)的核心基因（圖1A）并生成PPI網(wǎng)絡(luò)（圖1B），發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）位于網(wǎng)絡(luò)的核心。為確定TPL對MI作用的詳細(xì)機(jī)制，基于126個核心靶點(diǎn)進(jìn)行了GO富集，主要集中在生物過程（BP）（圖1C）的分析，基于PPI網(wǎng)絡(luò)和GO富集的生物信息，使用Cytoscape軟件形成了化合物-靶點(diǎn)-生物過程（C-TB）網(wǎng)絡(luò)（圖1D）。
圖1
2.TPL@PLGA@F127的表征
采用雙乳化-溶劑蒸發(fā)法合成具有球形結(jié)構(gòu)的TPL@PLGA（圖2A），PLGA和TPL@PLGA的平均水動力直徑、多分散指數(shù)（PDI）和Zeta電位分別為157.67±1.06 vs.163.63±3.72nm、0.24±0.02 vs. 0.24±0.02和-13.93±1.02 vs.-11.97±0.7mV，TPL@PLGA包封率為9.04%（圖2B）。在F127中加入PLGA納米顆粒并沒有顯著改變F127水凝膠的系數(shù)，F(xiàn)127和TPL@PLGA@F127的相變臨界溫度均為23℃（圖2C）。
圖2
3.TPL在TPL@PLGA@F127平臺中的體外釋放和體內(nèi)滯留
TPL@F127在第4天體外釋放率接近100%，而TPL@PLGA和TPL@PLGA@F127的釋放率分別為56.21±3.53%和23.81±3.30%（圖2D）。將DIR標(biāo)記的DIR@PLGA和DIR@PLGA@F127注射到MI后1小時和24小時的大鼠心肌內(nèi)。注射后1h，部分DIR@PLGA已從心肌中脫落，而DIR@PLGA@F127則全部集中在注射部位。在24 h時，DIR@PLGA的熒光強(qiáng)度與背景熒光強(qiáng)度相同，而DIR@PLGA@F127仍然可以觀察到熒光（圖2E和F）。
4.TPL@PLGA@F127在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中調(diào)節(jié)免疫過程
TPL濃度超過20nM時可顯著抑制巨噬細(xì)胞的活力，而TPL@PLGA或TPL@PLGA@F127處理的細(xì)胞，即使在較高的TPL濃度下也沒有明顯的抑制作用（圖3A）。20nM的TPL濃度下調(diào)了巨噬細(xì)胞表面CD86（M1巨噬細(xì)胞亞型標(biāo)記）的表達(dá)，上調(diào)了CD206（M2巨噬細(xì)胞亞型標(biāo)記）的表達(dá)（圖3B）。TPL@PLGA@F127組和TPL@F127組在增加CD206陽性細(xì)胞和減少CD86陽性細(xì)胞方面效果更好（圖3C-E）。
圖3
5.TPL@PLGA@F127早期生物安全性評價(jià)
對各組大鼠主要臟器的結(jié)構(gòu)進(jìn)行評估，TPL（i.p.）組肝組織炎性細(xì)胞浸潤、壞死、細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損（箭頭所示），TPL（i.p.）組腎組織有嚴(yán)重的細(xì)胞水腫和空泡變性，而TPL@PLGA@F127組未觀察到這些異常（圖4）。
圖4
6.TPL@PLGA@F127具有優(yōu)異的長期抗炎效果
巨噬細(xì)胞是參與慢性炎癥過程的主要炎癥細(xì)胞，CD68是巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。TPL@PLGA+F127組巨噬細(xì)胞浸潤明顯少于TPL@F127組（圖5A,5B）。TPL@PLGA@F127在梗塞心肌中表達(dá)TNF-α較少，IL-10較多（圖5C-F）。
圖5
7.TPL@PLGA@F127抑制心肌細(xì)胞凋亡保護(hù)心肌微結(jié)構(gòu)
TPL@PLGA@F127組的TUNEL陽性細(xì)胞率低（圖6A-C）。TPL@PLGA@F127、TPL@PLGA和TPL@F127均能降低Caspase 3剪切體的表達(dá)（圖6D和E）。TPL@PLGA@F127組、TPL@PLGA組和TPL@F127組與生理鹽水組相比在梗死心肌中有更高的連接蛋白43（CX43）和α-肌動蛋白表達(dá)（圖6B）。TPL@PLGA@F127組與TPL@PLGA組和TPL@F127組相比，CX43和α-肌動蛋白的表達(dá)量最高（圖6F）。
圖6
8.TPL@PLGA@F127增強(qiáng)心肌梗死后的心功能
在治療后第28天通過超聲心動圖測定心臟功能（圖7）。與生理鹽水組相比，TPL@PLGA組、TPL@F127組和TPL@PLGA@F127組的左心室射血分?jǐn)?shù)（EF，圖7G）和縮短分?jǐn)?shù)（FS，圖7D）升高，舒張末期左心室內(nèi)徑（LVIDd，圖7C）、收縮末期左心室內(nèi)徑（LVIDs，圖7B）、舒張末期容積（EDV，圖7F）和收縮末期容積（ESV，圖7E）均有不同程度的下降（圖7A-G）。
圖7
9.TPL@PLGA@F127抑制心肌纖維化
生理鹽水組膠原體積最大，心室厚度最薄。與生理鹽水組相比，TPL@PLGA@F127組的心室厚度正常，膠原沉積更少（圖8A和8C-D）。TPL@PLGA@F127組的膠原I/III比值明顯低于其他組（圖8B，E）。TPL@PLGA@F127能顯著降低膠原I的表達(dá)和膠原I/III的比例（圖8F-H）。
圖8
結(jié)論
這項(xiàng)研究基于PLGA的緩慢降解、F127的心內(nèi)滯留以及二者之間的協(xié)同作用開發(fā)了一種長效水凝膠平臺（TPL@PLGA@F127）。研究結(jié)果表明TPL@PLGA@F127不僅對心肌梗死有良好的治療效果，還能減輕TPL對正常器官的毒性。TPL@PLGA@F127能在3天內(nèi)使巨噬細(xì)胞向抗炎表型（M2巨噬細(xì)胞）極化，從而更有效地減輕心肌梗死的炎癥過程，在早期階段保護(hù)心肌細(xì)胞，并長期改善心臟功能。
索萊寶產(chǎn)品亮點(diǎn)
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