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AlphaFold 3問世，一鍵實現(xiàn)抗體藥開發(fā)近在眼前？
AlphaFold 3在預(yù)測生物分子的結(jié)構(gòu)和相互作用方面取得了突破性進展，其預(yù)測精度相比現(xiàn)有方法至少提高了50%【1】。這項技術(shù)不僅能夠模擬蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，還能模擬DNA、RNA以及藥物配體等大型生物分子，并預(yù)測其在空間中的相互作用關(guān)系，為藥物發(fā)現(xiàn)和疾病治療提供了新的視角。
AlphaFold 3的問世引起醫(yī)藥研發(fā)、疾病治療領(lǐng)域的轟動，特別是在抗體藥物的研發(fā)中，需要精確了解抗體與其目標分子之間的相互作用，這是決定藥物療效的關(guān)鍵。AI技術(shù)為我們發(fā)現(xiàn)抗原抗體相互作用帶來了巨大提速，但抗體藥研發(fā)是一項復(fù)雜的科學(xué)工程，我們依然面臨許多挑戰(zhàn)。
治療性抗體藥競爭激烈，企業(yè)研發(fā)如何脫穎而出
2023年，F(xiàn)DA批準了12種新的抗體藥物上市，其中包括8種單克隆抗體和4種雙特異性抗體。
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在這批新批準的單抗藥物中，值得一提的是渤健制藥開發(fā)的侖卡奈單抗（Lecanemab）【2】。這款藥物針對β-淀粉樣蛋白，是阿爾茨海默病治療領(lǐng)域的重要突破。據(jù)預(yù)測，侖卡奈單抗的市場銷售額將達到18.67億美元，將成為該領(lǐng)域重磅新藥【3】。
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在雙特異性抗體藥物方面，2023年在血液腫瘤領(lǐng)域有多款新藥獲批上市。例如，Elrexfio和Talvey是用于治療多發(fā)性骨髓瘤的新藥，分別針對BCMA/CD3和GPRC5D/CD3靶點。此外，Epkinly和Columvi是用于治療大B細胞淋巴瘤的新藥，均靶向CD20和CD3【4】。
不同類型的抗體類新藥開發(fā)進展及疾病領(lǐng)域
從近年來開展臨床試驗的抗體類型來看，單特異性抗體仍是抗體藥物研發(fā)的焦點，其臨床研究熱度在近三年內(nèi)并無顯著變化。雙特異性、多特異性抗體和抗體偶聯(lián)藥物領(lǐng)域的研究熱度呈現(xiàn)上升趨勢，但多特異性抗體仍占據(jù)較小比例【3】。
從靶點選擇上來看，目前已上市的抗體藥物主要是針對PD-1/L1、HER2、CD20、TNF-α、IL-6等熱門靶點。其中，PD-1/L1是近年來熱門的靶點之一，呈現(xiàn)出激烈競爭的態(tài)勢。
Nature Reviews Drug Discovery 20, 10 (2021)
先進生物分析技術(shù)，突破抗體藥研發(fā)難點
盡管抗體藥物的發(fā)展前景廣闊，但在研發(fā)過程中仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。
1 新靶點難以開發(fā)
抗體藥物的開發(fā)過程中，首要挑戰(zhàn)之一就是新靶點的開發(fā)。盡管已經(jīng)有許多已知的藥物靶點，但是在某些疾病，特別是一些罕見疾病和復(fù)雜的多因素性疾病中，仍然缺乏有效的靶點。此外，對于已知的靶點，也需要進一步研究其在疾病發(fā)生和發(fā)展中的作用，以便開發(fā)出更有效的抗體藥物【5】。
在這一過程中，先進的生物分析技術(shù)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。2023年Cancer Research發(fā)表了一篇關(guān)于針對EGFR/HER3靶點的創(chuàng)新雙特異性抗體藥物偶聯(lián)物BL-B01D1的文章，研究表明BL-B01D1在多種癌癥（如非小細胞肺癌 (NSCLC) ）的I期臨床試驗中表現(xiàn)出優(yōu)異的療效【6】。
BL-B01D1來源于SI-B001（也稱為SI-1X6.4）四價雙特異性抗體，CN116490523A描述了采用Octet® 非標記分子互作系統(tǒng)高通量地分析與準確地表征SI-1X6.4的結(jié)合活性。在親和力檢測的基礎(chǔ)上，Octet® 還驗證了SI-1X6.4具備同時結(jié)合HER3與EGFR靶點的特性，從而實現(xiàn)雙特異性抗體1+1＞2的協(xié)同作用。
Octet® 非標記分子互作系統(tǒng)能夠測量抗體與其靶標之間的相互作用，包括結(jié)合親和力、動力學(xué)參數(shù)以及濃度依賴性分析。這些信息對于理解抗體與新靶點的相互作用至關(guān)重要，有助于篩選和優(yōu)化潛在的抗體藥物候選物。
2 篩選效率低下
抗體藥物研發(fā)通常需要大規(guī)模篩選，以確定具有活性和選擇性的候選藥物。然而，傳統(tǒng)篩選方法效率低，耗時耗力。隨著技術(shù)的發(fā)展，一些新的高通量篩選技術(shù)已經(jīng)開始應(yīng)用于抗體的篩選過程。
ImmunoPrecise Antibodies公司采用iQue® 高通量流式細胞儀和ForeCyt® 軟件，優(yōu)化了單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)流程，顯著提高了單克隆抗體發(fā)現(xiàn)的效率。這項高通量技術(shù)能夠快速檢測大量細胞克隆的抗原表達，在5分鐘內(nèi)完成96孔板的檢測，極大縮短了篩選時間。在血清評估階段，將近2,500份血清樣品通過獨特的編碼技術(shù)進行了抗體結(jié)合評估，確保了抗體的特異性。在雜交瘤篩選過程中，通過多重細胞結(jié)合分析，9,600個雜交瘤克隆的上清液在一天內(nèi)完成了抗體結(jié)合和特異性的測定。
這些技術(shù)的應(yīng)用不僅加快了抗體Leads的產(chǎn)生，還通過“微型化”分析模式降低了成本，節(jié)省了寶貴的抗體上清液，為后續(xù)的驗證性或功能性研究提供了資源。
iQue® 高通量流式細胞儀加速靶點篩選流程：
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快速分析多參數(shù)：iQue® 可以在單個實驗中分析多個標記物，這有助于識別和確認疾病相關(guān)的特定細胞表面標記物。這種多參數(shù)分析能夠處理大量樣本，提供關(guān)于不同細胞群體的詳細信息。
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高通量篩選：iQue® 能夠快速篩選大量的細胞樣本和抗體，這有助于快速鎖定具有治療潛力的抗體候選物。處理 96 孔板僅需 5 分鐘，或在 20 分鐘內(nèi)處理384 孔板。
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微量化：獨特的采樣技術(shù)，可以從微量樣本中采樣，最少只需一微升, 節(jié)約珍貴的樣本和試劑。
3 開發(fā)中的工藝優(yōu)化
在抗體開發(fā)過程中，抗體表達需要進行哺乳動物細胞培養(yǎng)液收獲的實驗。處理哺乳動物細胞培養(yǎng)液極為困難，經(jīng)常需要快速完成任務(wù)，同時盡可能減少細胞培養(yǎng)液的損失。
在實驗室規(guī)模的澄清過程中，廣泛采用的方法是先進行離心，然后用0.2, 0.22或0.45 μm 過濾器過濾清除的上清液。傳統(tǒng)的離心和過濾過程存在速度慢、易堵塞、處理量低、質(zhì)量差（如內(nèi)毒素污染）等的局限性。
Sartoclear Dynamics® Lab套裝專為實驗室而設(shè)計，可快速收獲15 mL至1,000 mL體積的細胞培養(yǎng)液，免去澄清所需的離心步驟，一步完成澄清和除菌過濾。幾分鐘內(nèi)就能輕松快速地澄清和除菌多達1,000 mL的細胞培養(yǎng)液。
尋找下一代抗體發(fā)現(xiàn)的新方向
面對現(xiàn)有挑戰(zhàn)，科研界正在積極探索新的技術(shù)路徑。其中，高通量單B細胞克隆技術(shù)和人工智能（AI）輔助的抗體設(shè)計成為了研發(fā)新一代抗體藥物的兩大前沿方向。
1 高通量單B細胞克隆技術(shù)
在抗體發(fā)現(xiàn)中，使用免疫動物并將其免疫B細胞永生化為雜交瘤是傳統(tǒng)的方法之一，但這種方法存在一些勞動密集、耗時和吞吐量有限的缺點。因此，直接挖掘原代B細胞抗體庫的技術(shù)對于抗體發(fā)現(xiàn)越來越重要，高通量單B細胞克隆技術(shù)應(yīng)運而生。
高通量單B細胞克隆技術(shù)通過從免疫動物中提取B細胞，并利用高通量篩選技術(shù)快速、準確地分析大量單個B細胞的抗體基因序列，有助于我們挖掘更多潛在的抗體候選物。
最近的一篇來自于牛津大學(xué)的文章中【7】，作者使用CellCelector全自動無損細胞分離系統(tǒng)作為分離原代B細胞以發(fā)現(xiàn)抗體的平臺。該研究篩選了CD138+ B細胞的子集，在1189個抗體分泌細胞 (ASC) 中鑒定出238個潛在的EGFR特異性B細胞，并通過CellCellector成功篩選并分離出94個高產(chǎn)量陽性克隆。鑒定了一組不同的重鏈互補決定區(qū)序列，并將其中20個克隆表達為標準人免疫球蛋白G1抗體形式。進一步表征并鑒定了13種結(jié)合可溶性和天然形式EGFR的重組抗體。
通過將該方法擴展至從一種EGFR免疫的XenoMouse®（首批完全人類轉(zhuǎn)基因抗體生成動物之一）中提取的所有400,000個CD138+ B細胞，研究人員發(fā)現(xiàn)了潛在的1196種獨特的EGFR特異性抗體。CellCelector平臺的優(yōu)勢在于能夠分離特定感興趣的治療靶點的B細胞。此外，從分離的B細胞中回收的抗體序列成功結(jié)合可溶性和天然形式的EGFR，進一步驗證了CellCellector作為一種有效的抗體發(fā)現(xiàn)平臺的潛力。
代表性熒光和明場圖像，展示了從納米孔中挑選一個EGFR+ ASC并將其轉(zhuǎn)移到含有裂解緩沖液的96孔PCR板的B1孔中進行分子回收。圖像居中并自動分配綠色輪廓到要挑選的孔和B細胞。
（A）647 nm特異性熒光發(fā)射（紅色）的圖像，可以觀察到兩個相鄰的孔包含ASC。（B）488 nm特異性熒光發(fā)射（綠色）的圖像，可以觀察到一個相鄰的孔包含特異于EGFR的ASC。（C）647 nm和488 nm通道圖像的疊加圖像，以及（D）用于挑選EGFR+ ASC的明場圖像。明場圖像（E）在從納米孔中挑選EGFR+ ASC之前，以及（F）在挑選之后。明場圖像顯示納米孔內(nèi)的所有內(nèi)容物都被挑選出來。
由此可見，賽多利斯的CellCelector系統(tǒng)結(jié)合了獨特的納米孔技術(shù)和高通量細胞篩選、成像、靈敏的單細胞測定以及精準細胞分離功能，使得在同一天內(nèi)處理數(shù)千個血漿單B細胞成為可能。通過單細胞分析，CellCelector能夠檢測到傳統(tǒng)篩選方法難以發(fā)現(xiàn)的稀有抗體特性。該系統(tǒng)的熒光篩選功能具有高靈敏度和多通道檢測能力，能夠?qū)崟r獲取并分析熒光圖像，精確識別目標B細胞。CellCelector還支持立即對單個細胞進行多種測試分析，避免了傳統(tǒng)方法中需要培養(yǎng)數(shù)周以獲得足夠細胞數(shù)量的步驟。這些特點使得CellCelector在B細胞篩選中表現(xiàn)出色，廣泛應(yīng)用于抗體發(fā)現(xiàn)、免疫監(jiān)測和單細胞研究等領(lǐng)域。
全自動無損細胞分離系統(tǒng)實現(xiàn)自動化單B細胞及分泌物篩選和分離
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CellCeIector與獨特的納米孔技術(shù)相結(jié)合，并將高通量細胞掃描成像、分析篩選、單細胞和克隆自動化分離結(jié)合，實現(xiàn)了同一天共同處理數(shù)萬個血漿單B細胞的操作
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CellCeIector基于精準且溫和的機械挑取模式，確保細胞的高存活率
2 人工智能（AI）輔助的抗體設(shè)計
人工智能在抗體設(shè)計領(lǐng)域的應(yīng)用展現(xiàn)出了巨大的潛力。AI技術(shù)可以幫助我們預(yù)測和模擬抗體與抗原的相互作用，從而加速抗體設(shè)計的過程。通過機器學(xué)習算法和大數(shù)據(jù)分析，AI可以幫助我們優(yōu)化抗體的親和性、特異性和穩(wěn)定性，進而設(shè)計出更加高效和理想的抗體藥物。
艾諾森、義翹神州和南方研究院的合作研究表明，AI設(shè)計的抗體能夠針對多種SARS-CoV-2毒株提供廣泛中和能力【8】。在這項研究中，研究團隊通過整合多種數(shù)據(jù)類型和處理策略，如機器學(xué)習、自然語言處理、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模和蛋白質(zhì)序列語言建模，成功生成了SARS-CoV-2的數(shù)字孿生，并計算設(shè)計針對1300多種不同SARS-CoV-2歷史毒株的廣泛中和抗體。這些毒株在受體結(jié)合域（RBD）區(qū)域包含64個突變。經(jīng)過實驗驗證，AI設(shè)計的抗體在針對多種毒株的真實病毒中和測定中表現(xiàn)出良好效果，包括最新的Omicron毒株。許多抗體在ELISA測定中展現(xiàn)出對多種毒株RBD的強大結(jié)合能力。
基于人工智能的 SARS-COV-2 廣泛中和抗體設(shè)計
這些結(jié)果為塑造未來病毒株的治療設(shè)計提供了重要參考，并有助于預(yù)測病毒進化中的潛在模式。人工智能可以通過學(xué)習這些模式來開發(fā)未來的抗病毒治療方法。
未來展望
隨著生物技術(shù)的不斷進步，治療性抗體的研發(fā)正處于快速發(fā)展之中。面對行業(yè)發(fā)展的各種挑戰(zhàn)和痛點，采用先進的技術(shù)和綜合性解決方案是提高研發(fā)效率、降低成本、保證藥物質(zhì)量和安全的關(guān)鍵。
-參考文獻
【1】Abramson, J., Adler, J., Dunger, J. et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07487-w
【2】van Dyck CH, Swanson CJ, Aisen P, et al. Lecanemab in early Alzheimer’s disease. N Engl J Med, 2023, 388: 9-21
【3】Urquhart L. FDA new drug approvals in Q1 2023. Nat Rev Drug Discov, 2023, 22: 346
【4】韓佳，曾文曄，史彤，陳琪，謝運飛，張華，& 陳大明. (2024年1月). 2023年新藥研發(fā)發(fā)展現(xiàn)狀與未來趨勢.文章編號：1004-0374(2024)01-0094-08. https://doi.org/10.13376/j.cbls/2024012
【5】Weiner, G. J. (2015). Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer, 15(6), 361–370. https://doi.org/10.1038/nrc3930
【6】Wan, W., Zhao, S., Zhuo, S., Zhang, Y., Chen, L., Li, G., Renshaw, B., Khalili, J. S., Xiao, S., & Zhu, Y. (2023). BL-B01D1, a novel EGFR×HER3-targeting ADC, demonstrates robust anti-tumor efficacy in preclinical evaluation [abstract]. In: Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting 2023; 2023 Apr 14-19; Orlando, FL. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res, 83(7_Suppl):Abstract nr 2642.
【7】Matochko, W. L., et al. (2022, January 4). CellCelector™ as a platform in isolating primary B cells for antibody discovery. Antibody Therapeutics, 5(1), 11-17. https://doi.org/10.1093/abt/tbab030
【8】Kang, Y., Jiao, Y., Jin, K., & Pan, L. (2023). AI-Designed, Mutation-Resistant Broad Neutralizing Antibodies Against Multiple SARS-CoV-2 Strains. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2023.03.25.534209