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酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)C1q測(cè)定法
閱讀：654 發(fā)布時(shí)間：2011-10-24| 提 供 商 | 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司 | 資料大小 | 23.5KB |
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1 原理包被于塑料板上的固相凝聚IgG與酶聯(lián)C1q的結(jié)合受標(biāo)本中免疫復(fù)合物的抑制，是一種競(jìng)爭性抑制試驗(yàn)。為避免標(biāo)本中內(nèi)源C1q的干擾，應(yīng)預(yù)先用IgG免疫吸附劑將其除去。
2 材料
（1） 聚苯乙烯反應(yīng)板，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。
（2） 免疫吸附劑系結(jié)合有IgG的纖維素。取纖維素（5%，pH值105）與溴化*一起室溫反應(yīng)10min，用01mol/L碳酸氫鈉緩沖液（pH值80）充分洗滌。再與IgG一起于4℃下作用18h（20ml緩沖液中含3g纖維素和100mg IgG）。制備物用27mol/L甘氨酸緩沖液（pH值80）配成20%（W/V）懸液，貯于4℃。
（3） 酶聯(lián)C1q用戊二醛法將辣根過氧化物酶標(biāo)記C1q，再經(jīng)超濾AmiconXM200濾膜）分離貯于－20℃。
（4） 其他試劑002mol/L TrisHCl緩沖液（pH值90）；02mol/L TrisHCl緩沖液（pH
值7.4），以及含005%Tween20的同一緩沖液；02mol/L EDTA （pH值76）；酶底物溶液和中止液。
3 方法
（1） 包被凝聚IgG取經(jīng)002mol/L TrisHCl緩沖液（pH值90）透析過夜的凝聚IgG（100μg/ml），加入聚苯乙烯板孔內(nèi)，每孔100μl，37℃包被30min后，用緩沖液洗3次（第1次、第3次用02mol/L TrisHCl緩沖液（pH值74）；第2次用含005% Tween20的同一緩沖液） ,真空干燥，貯于4℃。
（2） 取血清標(biāo)本50μl，加入02mol/L EDTA（pH值76）50μl，室溫作用10min，使內(nèi)源C1 q游離，然后加入IgG免疫吸附劑500μl，室溫振蕩20min，再以500r/min離心5min，得到1∶10稀釋的上清液。
（3） 取已包被凝聚IgG的塑料反應(yīng)板，每孔中加入上述上清液90μl，酶聯(lián)C1q10μl（1∶100 ～200稀釋液），室溫下反應(yīng)20min，然后用含02mol/L NaCl，005%Tween20的02mol/L TrisHCl緩沖液（pH值74）洗3次，再加入100μl底物溶液（pH值60、01mol/L磷酸鹽枸櫞酸鹽緩沖液50ml中，加入鄰苯二胺20mg，30%（W/V）過氧化氫10μl），室溫放30min，加入2mol/L硫酸50μl中止反應(yīng)，于492nm讀取吸光值。如果定量，可用凝聚IgG制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)出免疫復(fù)合物的相對(duì)含量。
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