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植物蛋白提取實驗說明
閱讀：752 發(fā)布時間：2023-9-4植物蛋白提取試劑適用于多種植物根，莖，葉及果實等的新鮮或凍存組織。植物組織成分復(fù)雜，含有較多酚類物質(zhì)、多糖、色素、次生代謝物質(zhì)等，致使植物蛋白質(zhì)的分離提取變得困難和復(fù)雜。本試劑采用優(yōu)化的試劑和程序，能有效提取多種植物中的可溶性和疏水性蛋白成分，有效去除植物組織所含的多酚、多糖、醌、色素、脂質(zhì)、次生代謝物質(zhì)等干擾蛋白質(zhì)研究的成分，使提取的蛋白質(zhì)處于蕞佳的活性狀態(tài)和檢測狀態(tài)，適應(yīng)于酶學(xué)活性測定，單向及雙向蛋白電泳，Western Blot和免疫共沉淀分析等蛋白質(zhì)研究實驗。
組成和規(guī)格：無色透明的提取試劑50 ml或100 ml。
貯存：4°C，密封避光1年。
用途：提取多種植物組織和細胞的可溶性和疏水性蛋白。如蘋果、花生、土豆、煙葉、菠菜、梅花等。
操作步驟：
1. 組織勻漿，必須充分勻漿，此步驟非常關(guān)鍵：
(1) 凍存組織勻漿：預(yù)先將研缽置于－20°C ~－70°C冰箱內(nèi)冷凍。取液氮凍存的植物組織，放入冰凍的研缽內(nèi)研磨至粉末狀，注意使組織一直處于冰凍狀態(tài)，如組織顏色加深或變黑通常表明組織已融化。將研磨好的組織轉(zhuǎn)移到EP 管中，按每200 mg植物組織加500 ul的比例加提取試劑，混勻后冰上放置20分鐘，其間可數(shù)次顛倒混勻，以便蛋白溶解。
(2) 新鮮組織勻漿：取新鮮組織放入研缽中，按每200 mg植物組織加500ul的比例加提取試劑，充分研磨使勻漿液中看不到大的塊狀或片狀組織，保證組織研磨破碎。轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，冰上放置20分鐘。
2. 離心：12000 g離心15分鐘，棄去沉淀。蛋白在上清中。
3. 取離心后的上清，轉(zhuǎn)移至新管，立即使用或－70°C凍存。通常上清內(nèi)植物色素已基本去除，如有少量殘留亦不影響蛋白定量及電泳實驗。建議用BCA方法進蛋白定量（我公司的BCA蛋白定量試劑盒#P1511）。
如進行雙向電泳或欲che底清除色素等雜質(zhì)可進行以下內(nèi)驟:
1. 取上清液加入4倍體積的丙酮或甲醇混勻，－20°C至少一小時以充分沉淀蛋白質(zhì)。
2. 12000 g離心15分鐘沉淀蛋白。
3. 棄去上清。自然干燥蛋白沉淀，依據(jù)試驗將沉淀溶于相應(yīng)的緩沖液。如進行Western Blot 亦可用提取試劑溶解。
常見問題及解決方法：
1. 提取的蛋白量少：
1) 組織蛋白含量較少，如水果等，可增加組織量；
2) 組織勻漿不充分，如纖維較多的組織，破碎較困難，應(yīng)適當(dāng)延長勻漿時間；
3) 組織過老或水分丟失致使其干燥，故盡量選用新鮮較嫩的組織；
4) 甲醇或丙酮沉淀后蛋白溶解不充分，應(yīng)延長溶解時間或使用較強的蛋白溶解劑。
2. 蛋白質(zhì)量不佳：
1)提取的蛋白有多酚或色素等雜質(zhì)殘留，可重復(fù)用丙酮或甲醇沉淀；
2) 蛋白質(zhì)降解，操作各步驟均應(yīng)在冰上進行；加入蛋白酶抑制劑。