葡聚糖凝膠色譜柱是一種廣泛應用于生物化學、分子生物學和生物技術領域的分離技術工具，以葡聚糖凝膠作為固定相，基于分子篩分原理，通過不同大小和性質的分子在凝膠介質中的滲透性差異實現(xiàn)分離。其核心優(yōu)勢在于操作簡便、分離效率高，尤其適用于蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的純化與分析。
葡聚糖凝膠顆粒具有三維網狀結構，網孔大小可控。當樣品溶液通過色譜柱時，大分子因無法進入凝膠顆粒內部，僅能沿顆粒間隙流動，路徑短、流速快，優(yōu)先被洗脫；小分子可進入顆粒內部，路徑長、流速慢，后被洗脫。
葡聚糖凝膠色譜柱的一般操作指南：
一、安裝與準備工作
選擇合適的色譜柱
根據(jù)待分離物質的分子量范圍選擇合適型號的葡聚糖凝膠。如前所述，不同型號對應不同的排阻極限，確保所選凝膠的分離范圍能夠覆蓋樣品中分子量的最大和最小值。例如，若樣品中蛋白質分子量在5000-50000Da之間，可選擇Sephadex G-50到G-100之間的合適型號。
準備緩沖液
按照實驗要求配置合適pH值和離子強度的緩沖液。緩沖液的選擇要考慮樣品的穩(wěn)定性和與凝膠的兼容性。一般來說，磷酸鹽緩沖液（PBS）或Tris-HCl緩沖液是常用的選擇，pH通常維持在中性左右（pH 6.5-8.0）。緩沖液需經過過濾（如使用0.45μm濾膜）以去除雜質，防止堵塞凝膠孔隙。
裝柱
將適量的葡聚糖凝膠干粉用去離子水或緩沖液充分溶脹。溶脹時間根據(jù)凝膠的類型和用量而定，一般需要數(shù)小時至過夜，以確保凝膠充分膨脹。溶脹過程中可適當攪拌，但要注意避免過度攪拌導致凝膠顆粒破碎。
在裝柱前，先將色譜柱垂直固定在合適的支架上，關閉柱底出口。在柱底放置一層濾網或玻璃纖維，防止凝膠流失。然后將溶脹好的凝膠沿玻璃棒緩慢倒入柱中，讓凝膠自然沉降，避免產生氣泡。在裝柱過程中，可輕輕敲擊柱壁，使凝膠分布更加均勻。
打開柱底出口，讓緩沖液緩慢流出，同時繼續(xù)加入凝膠，使凝膠柱高度達到所需長度。新裝好的柱子要用2-3倍柱體積的緩沖液進行平衡，以穩(wěn)定凝膠的環(huán)境和柱內壓力。
二、加樣與洗脫
樣品準備
將待分離的樣品用適當?shù)木彌_液進行溶解或稀釋，樣品濃度不宜過高，以免影響分離效果。一般蛋白質樣品濃度可在1-10mg/mL之間。同時，樣品要保持澄清，可通過離心（如10000rpm離心10分鐘）去除沉淀等雜質。
加樣
當柱子平衡好后，關閉柱底出口。用移液槍小心地將樣品沿著柱壁緩慢加入到凝膠表面上，盡量避免破壞凝膠表面。加樣量一般為柱床體積的1%-5%，具體可根據(jù)樣品性質和分離目的進行調整。加樣后，打開柱底出口，讓樣品慢慢滲入凝膠柱內。
洗脫
加樣完成后，連接好洗脫液（一般為用于平衡柱子的緩沖液）儲液瓶和柱頂端入口，開始洗脫。洗脫速度要控制適當，一般每分鐘1-2滴（約0.05-0.1mL/min），具體可根據(jù)凝膠類型和樣品情況優(yōu)化。
在洗脫過程中，要持續(xù)收集流出液，可使用自動部分收集器按一定體積（如1-2mL/管）進行收集。同時，監(jiān)測各收集管中物質的含量，可通過檢測吸光度（如在280nm處檢測蛋白質）或其他合適的檢測方法來確定目標物質的洗脫峰。
三、柱子的維護與后處理
柱子的清洗與再生
每次使用完畢后，要用2-3倍柱體積的緩沖液沖洗柱子，以去除殘留的樣品成分。如果柱子在使用過程中受到污染或性能下降，可進行再生處理。例如，對于一些吸附了雜質的柱子，可用適當?shù)那鍧崉ㄈ?.5-1M NaOH溶液）進行清洗，然后用大量去離子水沖洗干凈，重新平衡后再使用。
柱子的保存
如果柱子短期內不使用（幾天到幾周），可將柱子浸泡在20%乙醇溶液中，以防止微生物生長和凝膠干燥。將柱子兩端密封好，存放在4℃冰箱中。如果是長期不使用（幾個月以上），最好將凝膠倒出，干燥后保存在陰涼干燥處。
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