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顯微應(yīng)用 | 癌癥免疫學中的3D超多標成像(上)

閱讀:445      發(fā)布時間:2024-11-1
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癌癥免疫學中的3D多標記成像可更好地表征組織變化和細胞相互作用。本文介紹了一種在STELLARIS 共聚焦平臺上進行3D成像的單次、超多標工作流程,用于小鼠腫瘤組織成像。通過優(yōu)化成像設(shè)置和先進的拆分技術(shù),我們準確地拆分了來自15種標記物的信號,實現(xiàn)了細胞類型和功能狀態(tài)的精確識別。這種方法為癌癥研究提供了全面的工具,有助于深入理解腫瘤微環(huán)境。


在癌癥免疫學研究中,評估組織變化和細胞相互作用對于識別特定細胞類型、評估免疫細胞活化狀態(tài)、監(jiān)測特定蛋白質(zhì)和/或基因標記物的表達以及表征腫瘤微環(huán)境至關(guān)重要。不同樣本之間的參數(shù)變化(例如健康與病變、治療與未治療)通常非常復(fù)雜,并且發(fā)生在三維環(huán)境中。


腫瘤細胞與其微環(huán)境的相互作用在很大程度上決定了某種類型癌癥的特征,因此成像策略是研究腫瘤組織的自然選擇。現(xiàn)代成像技術(shù)與多種組學方法的結(jié)合在空間生物學這一新興領(lǐng)域中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。來自基因組學、 蛋白質(zhì)組學和代謝組學的信息,與結(jié)構(gòu)和空間-功能關(guān)系結(jié)合,可以提供其他方法難以獲得的洞見。



上述過程由分子和細胞之間復(fù)雜的相互作用驅(qū)動。因此,使用熒光成像研究這些過程的實驗設(shè)計需要能夠區(qū)分和定位大量標記物,由抗體識別并與合適染料結(jié)合的靶抗原。

常見的成像一組標記物的方法(即“面板")包括每次最多4個標記的依次染色/成像/去染步驟,隨后對圖像進行校準并重新定位樣品。


理論上,通過不斷迭代,可以成像無限數(shù)量的標記物,然而在實際操作中,隨著多標記數(shù)量的提高,這變得更加困難。此外,只有在實驗結(jié)束后,即最后一次染色/成像/去染以及多圖像疊加完成后,才能看到所有標記的結(jié)果。


這一點尤為關(guān)鍵,因為在任何給定時刻只有少量標記物可見。成像策略無法改變,如果出現(xiàn)意外或新的情況,也無法返回感興趣區(qū)域進行進一步探索或更改成像參數(shù),因為樣品已經(jīng)不再相同。


多圖像疊加增加了實驗的復(fù)雜性,因為每輪成像都需要一個共同特征或標記,作為基準,使所有標記能夠虛擬地組合在一起。一個廣泛使用的策略是在每次迭代中用 DAPI染色作為錨點,犧牲一個成像通道來進行核染色。另一個限制在于染色/去染步驟的化學性操作,存在改變抗原和/或樣品物理完整性的風險,從而降低多標記結(jié)果的質(zhì)量。最后,3D信息的重建并非經(jīng)典流程中的操作,由于樣品重定位和循環(huán)染色導(dǎo)致的變形,使得這一步變得極其困難。


單次成像方法提供了強大的優(yōu)勢,可以克服超多標應(yīng)用的一些挑戰(zhàn)。


由于所有多標信息同時獲取,研究人員可以探索和調(diào)整成像策略,保護樣品免受嚴苛的去染處理,并直接在3D中獲得數(shù)據(jù)的結(jié)果,帶來額外維度的信息豐富性。


在此,我們通過對小鼠腫瘤組織進行的單次3D 15標(即15種標記物)實驗展示了這種方法的潛力(圖1a)。

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圖1:單次超多標工作流程。a, 3D 15標成像實驗概覽。該樣品(固定的小鼠腫瘤組織)使用單輪標記方法對15種生物標記物進行染色,并在配備SpectraPlex功能的STELLARIS平臺上進行3D圖像采集。內(nèi)置的高級拆分技術(shù)能夠準確地分離每種標記物的信號,從而實現(xiàn)細胞類型和功能狀態(tài)的后續(xù)識別。b, 本研究中使用的15標面板,顯示了標記物(染料-靶標組合)及其染料發(fā)射光譜。

選擇15種標記物使得科研工作者能夠?qū)υ摻M織中的一組免疫細胞、癌癥特征和結(jié)構(gòu)標志物進行功能描述。


樣品準備過程中,將小鼠胰腺導(dǎo)管腺癌細胞(KPC-4662)皮下注射到C57Bl/6小鼠體內(nèi),并允許其生長3周。然后取出腫瘤,固定并制備厚度為70微米的切片并進行染色。

我們選擇了一組目標,以探討免疫腫瘤微環(huán)境

T細胞(CD4, CD8)

B細胞(B220)

髓系細胞(包括樹突細胞)

T細胞的功能標記(TCF1, FoxP3, PD1)

此外,實驗還包括了結(jié)構(gòu)性和與癌癥相關(guān)的標記物:

增殖標記(Ki67)

基質(zhì)細胞(α-SMA, MHC I)

上皮細胞(E-鈣黏蛋白, MHC I)

細胞外基質(zhì)(Tenascin C)

內(nèi)皮細胞(CD31)(圖1b)

使用STELLARIS共聚焦顯微鏡進行成像,該顯微鏡配備了名為SpectraPlex的新功能,專門為超多標成像方法提供一組工具。共聚焦功能不僅可以獲取薄組織切片的大視野圖像(如寬場的迭代成像方法),還可以在整個z范圍內(nèi)生成3D 圖像。高分辨率的3D數(shù)據(jù)支持空間分布模式的全面探索。


利用SpectraPlex,該15標實驗的步驟由“標記面板"引導(dǎo)。這些標記物通過在軟件中定義生物目標和染料的組合來實現(xiàn),并可添加到一個名為“虛擬冰箱"的數(shù)據(jù)庫中。數(shù)據(jù)庫中存儲了實驗室中常用或自創(chuàng)建的標記物。


將相關(guān)的標記物從虛擬冰箱中移動到專用工具中,即可創(chuàng)建面板通過實時計算,面板為顯微鏡采集設(shè)置提供建議。這為儀器的后續(xù)交互操作提供實驗控制的指導(dǎo),而手動優(yōu)化選項則為經(jīng)驗豐富的用戶提供了靈活性。


在此示例中,基于先前經(jīng)驗和商業(yè)染料設(shè)計確定了特定的目標-染料組合。我們利用了整個激發(fā)光譜范圍 (405nm及440–790nm)和熒光發(fā)射光譜(高達850nm)(圖1b)。




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