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QQ交談技術(shù)文章
HtPot40干式恒溫金屬浴在耐亞胺培南銅綠假單胞菌CARB-3基因發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用
點(diǎn)擊次數(shù)：4001 發(fā)布時(shí)間：2011-2-25
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）是臨床常見的條件致病菌，由于其固有和獲得性耐藥，使臨床治療成為一大難題。CARB基因編碼產(chǎn)生羧芐西林酶，為β-內(nèi)酰胺酶Bush分類中的2c，在我國CARB基因、流行基因亞型的研究未見報(bào)道。我們研究分析了2005年1～12月臨床分離的34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌（IMPRPa），發(fā)現(xiàn)了我院IMPRPa攜帶CARB-3基因，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。
1 材料與方法
1.1 菌株來源與質(zhì)控菌株 34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌來自于2005年1～12月我院住院病人的臨床分離標(biāo)本（包括：痰液、尿液、傷口分泌物、膿液、血液等），質(zhì)控菌株包括：銅綠假單胞菌ATCC27853，大腸埃希菌ATCC25922。
1.2 菌株鑒定及亞胺培南耐藥菌株篩選 試驗(yàn)菌株經(jīng)BD Phoenix100全自動(dòng)微生物分析儀鑒定到種，采用該儀器配套藥敏試驗(yàn)復(fù)合板篩選亞胺培南耐藥的Pa。
1.3 主要儀器設(shè)備與試劑 Eppendorf centrifuge 5417R 低溫離心機(jī)，HtPot40干式恒溫金屬?。ê戏拾旧?，Bio-RAD電泳儀，Bio-RAD 凝膠成像系統(tǒng)， 瓊脂糖（OXOID），100bp DNA Ladder Marker（大連寶森），6×Loading buffer（北京天為時(shí)代）。
1.4 模板DNA提取 采用蛋白酶K消化法。
1.5 基因擴(kuò)增 引物序列為：P1：5′-AAA GCA GAT CTT GTG ACC TATTC -3′，P2： 5′-TCA GCG CGA CTG TGA TGT ATA AAC -3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為588bp。熱循環(huán)參數(shù)為：93℃預(yù)變性3min，93℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 60s，zui后一個(gè)72℃ 延伸5min，共循環(huán)35周期。純水為陰性對(duì)照。耐藥基因檢測(cè)試劑盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。
1.6 結(jié)果判斷 取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物與2μl 6×上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠，在100V電壓電泳30min，出現(xiàn)588bp的條帶即為CARB基因陽性。用凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。
1.7 序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工生物工程公司進(jìn)行DNA序列分析，測(cè)得序列在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST 中的BLASTn程序進(jìn)行同源性和基因亞型分析。
2 結(jié)果
2.1 CARB基因PCR檢測(cè)結(jié)果 34株耐亞胺培南銅綠假單胞菌共檢出11株CARB基因陽性株，檢出率為32.4%，PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。
2.2 序列分析結(jié)果 任意抽取5株CARB基因陽性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單向測(cè)序，測(cè)得序列與GenBank中注冊(cè)號(hào)為DQ309773的CARB-3基因*同源（Identities=100%）。因此我院流行的CARB基因亞型為CARB-3型。
圖1 部分Pa菌株CARB基因PCR產(chǎn)物電泳圖 （略）
3 討論
CARB基因zui早于1981年在Pa中發(fā)現(xiàn)［1］，近年又從不動(dòng)桿菌、弧菌屬、奇異變形桿菌中檢出，已發(fā)現(xiàn)CARB1-9型9個(gè)亞型［2～4］。我院IMPRPa的CARB基因攜帶率為32.4%，提示醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)重視和加強(qiáng)Pa的防治和耐藥監(jiān)測(cè)。對(duì)CARB基因陽性菌株進(jìn)行DNA序列分析，經(jīng)同源性比較，結(jié)果顯示：我院流行的CARB基因亞型為CARB-3型。IMPRPa中CARB基因檢出、CARB-3基因亞型發(fā)現(xiàn)為國內(nèi)報(bào)道。
銅綠假單胞菌是臨床常見的條件致病菌，正常情況下不感染人體任何組織，但當(dāng)人體免疫力下降或嚴(yán)重創(chuàng)傷或醫(yī)療操作后，Pa幾乎可以感染人體的任何組織，臨床可表現(xiàn)為局部化膿性炎癥和全身性感染，常常危及患者生命。碳青霉烯類抗生素（如亞胺培南）因其*的抗菌優(yōu)勢(shì)，被臨床廣泛用于Pa引起的重癥感染，導(dǎo)致臨床分離株對(duì)亞胺培南耐藥性增加。
Pa對(duì)亞胺培南耐藥的機(jī)制主要有膜孔蛋白缺失、外排泵和產(chǎn)酶等三種機(jī)制［5］。我們對(duì)IMPRPa的耐藥機(jī)制的相關(guān)研究正在進(jìn)行中。
作者：顏英俊 糜祖煌 劉華 楊洋 張凱 楊明清 黃文方 中華醫(yī)學(xué)研究雜志
【參考文獻(xiàn)】
1 Paul G,Joly G ML,Bergogne BE,et al.Novel carbenicillin-lydrolyzing β-lactamases（CARB-5）from Acinetobacter calcoaceticus var.anitratus.FEMS Microbiol Lett，1989,50（1-2）:45.
2 Alejandro P,Roberto G M,Hector AS,et al.CARB-9 a carbenicillinase encoded in the VCR region of Vibrio cholerae Non-O1,Non-O139belongs to a family of cassette-encoded β-lactamases.Antimicrob Agents Chemother，2004,48（10）:4042.
3 Nucleotide sequence of the blaRTG-29CARB-5） gene and phylogeny of a new group of carbenicillinases.Antimicrob Agents Chemother，2000,44（4）:1070.
4 Bert F,Branger C,Lambert-zechovsky N.Comparative activity of beta-lactam agents （carbapenem excepted）against Pseudomonas aeruginosastrains with CARB or OXA beta-lactamASES.Chemotherapy，2004,50（1）:31.
5 Okamoto K,Gotoh N,Nishino T.Pseudomonas aeruginosa reveals high intrinsic resistance to penem antibiotics:penem resistance mechanisms and their interplay.Antimicrob Agents Chemother,2001,45（7）:1964.
作者單位：1 610072 四川成都，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科2 214026 江蘇無錫，無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所